使用BioAccord LC-MS系统快速分析脂质纳米颗粒成分

COVID-19 mRNA疫苗近来的成功部分归功于脂质纳米颗粒(LNP)递送系统的发展。LNP中包含四种脂质成分（胆固醇、DSPC、可电离脂质和PEG化脂质），控制这些脂质的质量和纯度非常重要。我们使用ACQUITY Premier CSH C₁₈色谱柱和BioAccord系统开发了一种简单、快速、常规的LC-MS方法，用来表征和分析LNP成分。LNP成分、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、1,2-二亚油酸-3-二甲氨基丙烷(MC3)和PEG化脂质的检出浓度为5 pg/µL，胆固醇的检出浓度为250 pg/µL。开发的方法可用于分析复杂的牛肝脂质提取物，所有主要脂质类别都能检出。该方法可以同时分析LNP中的四种脂质成分以及其他由合成过程、降解或原料污染产生的杂质。

优势

• 一种简单、快速、常规的LNP脂质成分分析方法
• 在工艺开发和质量控制环境中同时分析LNP成分和杂质
• BioAccord系统结合waters_connect信息学平台为数据采集和处理提供了精简的分析工作流程
• 在BioAccord系统上，DSPC、可电离脂质和PEG化脂质的检测限低至5 pg/µL（柱上进样量25 pg），胆固醇的检测限低至250 pg/µL（柱上进样量1.25 ng）

脂质纳米颗粒(LNP)是mRNA疗法或疫苗的优选递送载体。SARS-CoV-2 mRNA疫苗临床试验近来的成功部分归功于脂质纳米颗粒递送系统的发展¹。 LNP可以实现高效封装，mRNA的大小几乎不受限制，因此比其他转基因递送载体更为独特^1,2。 就其在疫苗中的作用而言，它们具有刺激非特异性免疫系统而不诱导免疫原性的额外优势²。 此外，用LNP封装mRNA可以保护mRNA免受酶攻击，还可以增强细胞摄取和表达¹。LNP通常由四种脂质组成（图1），每种脂质都起着特定作用。LNP的主要成分为可电离/阳离子脂质，该成分通常占LNP组成的一半，可提升效价，是目前具有重要开发意义和知识产权的成分。早期临床试验中使用的LNP主要成分为1,2-二亚油酸-3-二甲氨基丙烷(Dlin-MC3-DMA (MC3))²。下一种普遍使用的脂质是胆固醇；它可以增强LNP的稳定性并促进膜融合^3,4。 还有另外两种脂质：聚乙二醇化脂质（PEG化脂质）和磷脂（如二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)），也称为辅助脂质。聚乙二醇(PEG)可降低聚集趋势并保护LNP免受免疫细胞的非特异性内吞作用影响。DSPC和胆固醇是天然脂质，可电离脂质和PEG化脂质是合成脂质。可电离脂质的化学结构、PEG化脂质的稳定性以及四种脂质的比例发生微小变化都会改变LNP的性质和递送效率¹。

LNP所用脂质材料的鉴定和纯度都属于关键质量属性，与之几乎同等重要的是监测和定量完整原料杂质和潜在降解物。液相色谱(LC)技术可以分离复杂混合物中的脂质，质谱技术可以进一步增加鉴定结果可信度，尤其是监测可能的微量杂质和降解物时。本研究我们将介绍一种简单、快速、常规的液相色谱-质谱(LC-MS)联用方法，采用ACQUITY Premier CSH C₁₈色谱柱和BioAccord系统分析LNP中的脂质成分。BioAccord系统配置包含ACQUITY UPLC I-Class PLUS、ACQUITY TUV检测器和ACQUITY RDa检测器。沃特世开发出一套稳定、易用且体积小巧的LC-MS平台 - BioAccord系统，旨在提供适用于生物治疗药物和核酸分析的MS分析方法，同时可供过去无法部署LC-MS技术的机构和操作人员使用。正如此前发布的出版物所示，通过结合ACQUITY UPLC I-Class PLUS系统和ACQUITY RDa质谱检测器，BioAccord系统能够自动完成色谱分离和精确质量数测定并且重现性高。该系统在符合法规要求的waters_connect信息学平台下运行，是脂质纳米颗粒产品开发和商业化团队获取脂质成分结构、组成和鉴定信息的理想选择。

样品描述

胆固醇、DSPC和MC3各自的脂质标准品均购自Sigma，DMG-PEG-2000购自Avanti Polar Lipids。用甲醇制备1 mg/mL的胆固醇和DMG-PEG-2000储备液。用甲醇/氯仿(1/1)制备1 mg/mL的DSPC和MC3储备液。用甲醇稀释储备液，制备每种脂质标准品或混合制品各种工作浓度的溶液。   

牛肝总脂质提取物购自Avanti Polar Lipids。用氯仿/甲醇(2/1, v/v)制备5 mg/mL的提取物储备液。然后用甲醇稀释储备液，制备0.1 mg/mL的工作溶液。

数据管理

使用waters_connect平台上运行的具有精确质量数筛查工作流程的UNIFI科学信息系统进行数据采集和处理。

LC-MS方法被广泛用于分离和分析不同来源的脂质，将其归类为不同的脂质或分子类别。正相(NP)色谱和亲水作用色谱(HILIC)是分离不同类别脂质的两种常用技术，而反相(RP)色谱多用于分离同一类别但分子种类不同的脂质。使用ACQUITY Premier CSH C₁₈ RP色谱柱分离LNP脂质成分相比其他RP色谱柱可提供更高的覆盖率和分离度^5,6。 这些脂质的紫外吸光度较低甚至没有，因此应使用替代检测器（例如ACQUITY RDa质谱检测器）来提高分析灵敏度。使用BioAccord系统分析通过甲醇稀释储备液得到目标浓度的混标。典型的提取离子色谱图见图2A。脂质的洗脱顺序为DMG-PEG-2000、胆固醇、可电离脂质MC3和DSPC。图2B显示了四种代表性脂质DMG-PEG-2000、胆固醇(m/z 369.352)、可电离脂质MC3 (m/z 642.627)和DSPC (m/z 790.618)的相应质谱图。DMG-PEG-2000的合并质谱图如图2B（上图）所示。DMG-PEG-2000在LC-MS条件下形成铵加合物，在谱图中观察到多个电荷态（+2、+3和+4）。

为鉴定各脂质成分，我们首先在UNIFI科学库中创建了一个包含各种脂质化合物的自定义数据库（谱库）。有关如何使用UNIFI科学库创建数据库的详细步骤说明，请参阅其他文件⁷。图3显示了采用UNIFI成分分析工作流程的样品分析结果示例，包括成分概要、色谱图和质谱图。图3A为成分概要表，其中列出了通过自定义脂质LNP数据库鉴定出的所有成分。每种鉴定出的脂质的提取离子色谱图、低能量母离子谱图和相应的碎片离子谱图分别见图3B、图3C和图3D。UNIFI将比较和匹配预期模拟碎片与实验得到的HRMS碎片，以进行结构表征。如果需要，可以单击蓝色图标检查每个碎片离子谱图，并将其发送到UNIFI科学库以创建包含碎片离子信息的自定义脂质LNP数据库。 

所有已鉴定脂质的结果都会显示在成分确认表（图4A）或成分图（图4B）中。图4A显示了DMG-PEG-2000、胆固醇、可电离脂质MC3和DSPC中已鉴定脂质的完整成分概要列表。在ESI正离子模式下，PEG化脂质在图4A中显示多种电荷态（+2、+3和+4）。此外，DMG-PEG-2000以不均一的多分散聚合物形式存在，并且包含长度不均匀的PEG链，范围从38到50个(CH₂CH₂O)单元不等。单分散聚合物是均一的聚合物，其中所有分子都具有相同的PEG聚合度，且m/z值相同且单一。基于PEG单元的多分散性，共鉴定出13种不同的PEG化脂质。 

使用各脂质储备液制备浓度范围0.1-500 pg/µL的系列稀释液，在六个浓度水平下进行分析，评估BioAccord系统的检测限。图5显示了浓度水平为1、5、50、100、250和500 pg/µL的可电离脂质MC3的代表性概要图。可电离脂质MC3、DSPC和DMG-PEG-2000的检测下限确定为5 pg/µL（柱上进样量25 pg），胆固醇的检测下限为250 pg/µL（柱上进样量1.25 ng）。 

UNIFI中的二元比较功能可直接比较未知脂质样品与参比样品的分析结果。该功能非常有用，可以用于生成脂质原料或目标产品的LC-MS图谱，以便区分类似产品，鉴别罕见杂质，或比较多个生产批次的脂质质量。用户还可以使用该功能结合提取离子色谱图（图6A）或指定质谱图（图6C和6E）来比较未知样品中各脂质的丰度和参比样品的丰度，并显示为镜像对比图。在这种二元样品比较模式中，用户可以设置特定的匹配标准（RT和质量精度），以确定未知样品和参比样品的峰需要接近到哪种程度，才能将这两个峰视为相同的脂质成分。图6A显示了进样0.1 mg/mL Avanti牛肝脂质提取物（参比）样品和进样0.1 mg/mL添加有DMG-PEG 2000和可电离脂质MC3的Avanti牛肝脂质提取物（标记为“未知”）样品得到的镜像对比色谱图。仅在未知（即加标）样品中观察到两个特有峰，保留时间分别为2.02和6.62 min，表明存在加入的DMG-PEG 2000和MC3脂质。色谱图差异图（图6B）显示了这两个仅在未知样品中鉴定出的峰。为使二元比较功能获得理想比较结果，LC-MS分析需要可重现的RT测定，且样品组中所有进样的MS响应需一致。 

图6C显示了DMG-PEG 2000未知样品和参比样品合并质谱图（保留时间为2.02分钟）的二元比较结果。参比样品和未知样品之间的谱图差异图如图6D所示。仅在未知样品谱图中清楚地观察到具有+2、+3和+4电荷态的特有PEG谱图模式（图6C和6D）。同样，可电离脂质MC3的未知样品（保留时间为6.62分钟）与参比样品的二元比较如图6E所示。参比样品和未知样品之间的差异图如图6F所示。MC3 (m/z 642.601)仅存在于未知样品中，谱图差异图表明MC3为未知样品中特有（图6E和6F）。

我们采用开发的方法分析复杂牛肝提取物，以证明该方法普遍适用于分析其他类型的脂质化合物。我们使用该方法检测了所有主要的溶血磷脂、磷脂和中性脂质（图7）。结果表明，该方法可同时测定LNP组成以及LNP配制过程中因潜在降解、氧化、水解、氢化、聚集和二聚体形成而产生的任何其他杂质。

我们开发了一种简单、快速、常规的反相LC-MS方法用于LNP成分分析，并在BioAccord系统上评估了该方法的性能，证明在工艺开发和质量控制中，该方法可以同时分析LNP成分与杂质。

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