人血清中PFAS的提取和分析

全氟和多氟烷基化合物(PFAS)具有生物蓄积性，监测这些化合物在人体液中的含量有助于了解暴露水平和暴露途径。由于PFAS不会快速代谢或从体内清除，因此可以通过研究这些化合物的血清含量来了解其暴露水平。本研究开发出一种优化的固相萃取(SPE)方法，利用Oasis WAX µElution 96孔提取板从人血清中提取PFAS。分析采用与ACQUITY UPLC I-Class PLUS系统联用的Xevo TQ-S micro完成，该系统已使用PFAS方法包组件进行改良。ACQUITY HSS T3色谱柱可实现PFAS与血清类固醇硫酸盐干扰物质的关键分离。使用六批不同的混合人血清进行方法验证。此外，使用NIST标准参考物质(SRM 1957)对优化的提取方法进行验证，获得始终准确的结果。证明最终方法准确耐用，适用于从各类不同的常见PFAS化学物质中提取并分析30种PFAS。

优势

• 一种经过优化的方法，适用于研究并了解PFAS化合物在人体中的暴露水平
• 利用PFAS方法包改良液相色谱系统，分离可能的系统和溶剂污染物，从而提高结果可信度
• 使用Xevo TQ-S micro准确分析人血清中PFAS的耐用方法
• 使用Oasis WAX 96孔板和理想色谱柱提取PFAS，实现高效样品净化

数十年来，全氟和多氟烷基化合物(PFAS)广泛应用于工业生产过程、各类消费品和消防泡沫，导致这些污染物持续释放到环境中。人们随后通过使用消费品、摄入受污染的饮用水和食品以及空气污染而持续暴露于PFAS。目前已知存在数千种PFAS，但有关它们的毒理学知识有限。有关全氟辛酸(PFOA)和全氟辛烷磺酸(PFOS)的研究表明，这些化合物严重危害人体健康，包括对免疫、生殖和发育途径的影响以及肝肾损害^1,2。 PFOA被视为一种与肾癌和睾丸癌有关的潜在致癌物^3,4。 PFAS具有较强的碳-氟键，可作为有效的涂层材料，但也非常难以代谢，因此很可能在人体中蓄积。根据大量生物监测研究的结论，大多数人的血液中均含有可检出量的各种PFAS化合物⁵。因此，有必要采用可靠、准确的方法持续监测PFAS在人体内的含量，以用于职业健康监测、环境暴露监测和毒理学研究等目的。

血清是一种复杂基质，要实现高重现性、高准确度的PFAS检测，必须去除基质化合物。当研究范围不断扩展至更多种类的PFAS时，这一点尤为重要，因为研究重点已经从仅研究PFOA和PFOS转向更广泛的化合物。仅采用蛋白沉淀法和/或稀释进行样品前处理难以满足要求。固相萃取(SPE)是一种更实用的样品前处理解决方案。液相色谱与串联四极杆质谱联用系统(LC-MS/MS)大幅提升了分析的灵敏度和选择性。下文将概述一套完整的SPE方法，该方法使用Oasis WAX 96孔µElution提取板从人血清中提取PFAS，然后利用Xevo TQ-S micro进行分析。

样品前处理

使用Oasis WAX 96孔µElution提取板（每孔包含2 mg吸附剂）通过固相萃取法提取人血清样品。提取胎牛血清(FBS)作为校准曲线的基质，它是合适的无PFAS基质替代品。完整的SPE萃取方案见图1。将NIST标准参考物质(SRM) 1957（未加标人血清）与每批样品一起萃取，确保成功完成样品前处理。本研究使用了一组PFAS，共30种化合物，代表各种PFAS类别，例如羧酸类、磺酸类、磺胺类、磺胺乙酸类、氟调聚物磺酸盐和全氟醚。在适用情况下，对每种化合物添加同位素标记的内标。

方法优化

使用Oasis弱阴离子交换(WAX)色谱柱进行SPE萃取，因为这款色谱柱已广泛用于从水体及其他环境样品中萃取PFAS。WAX同时提供阴离子交换和反相保留机理，能够保留各种PFAS化合物。因此，将从水中提取PFAS的基本方案经过适当调整后得到适用于血清的类似方法，主要是针对血清相应地调整了样品预处理和样品板清洗步骤。

已有研究证明，样品预处理是非常重要的步骤，还需要进一步优化，破坏血清样品中的PFAS蛋白结合。本研究比较了直接使用50%甲酸进行稀释与经过蛋白沉淀处理后再用1%甲酸进行稀释的方法。测试的蛋白沉淀比例有1:1乙腈、1:3乙腈和1:1甲醇（血清:溶剂）。进行蛋白沉淀后必须稀释有机相，使PFAS保留在WAX色谱柱上。为确定所测试的各种预处理方法的效率，将处理后的样品加载到WAX板，收集上样废液并分析。上样废液中PFAS的检测结果表明，PFAS并未在上样过程中保留，其仍然很有可能与血清基质中的蛋白质或其他组分结合。图2显示了使用该方法分析上样废液中的各种PFAS化合物得到的选定色谱图。从图中可以明显看出，经甲酸稀释的血清导致上样过程中发生大量穿透，因此需要进行蛋白沉淀。在测试的三种蛋白沉淀步骤中，1:3血清:乙腈法使PFAS几乎没有在上样时穿透。

由于存在SPE无法有效去除的血清特异性干扰物，因此还必须对色谱柱进行优化。已知多种类固醇硫酸盐（类固醇前体和降解产物的代谢物）会与PFAS（例如PFOS和PFHxS）共洗脱^6,7。 起初是利用ACQUITY BEH C₁₈色谱柱进行分析，以便与先前的PFAS应用一致，但这种方法使干扰物发生共洗脱。

图3通过比较PFHxS在BEH C₁₈和HSS T3色谱柱上得到的色谱图说明这一问题。使用BEH C₁₈色谱柱时，基质干扰物容易导致某个支化PFHxS异构体被遗漏或误判。此外，如果在正常自动化数据处理程序中对峰进行平滑处理，这种干扰物很可能也被平滑并积分到直链PFHxS峰中。这将导致样品中PFHxS的浓度被高估。使用HSS T3色谱柱成功分离了基质干扰峰，从而提供更准确可靠的结果。因此采用ACQUITY HSS T3色谱柱分析所有血清样品。

方法性能

本研究评估了使用FBS作为基质生成的校准曲线的线性和准确度，各种PFAS化合物的结果见图4。经证明，FBS是一种理想的无PFAS基质替代品，非常适用于本研究，并且在分析物回收率和响应方面的表现与人血清相似。校准曲线在测试的浓度范围0.05~20 ng/mL内呈线性，所有化合物的R²值均≥0.996。唯一例外是6:2 FTS，其R²值为0.992。此外，还评估了校准范围内各种化合物的残差值，以证明方法的准确度和重现性。残差百分比是衡量标准品计算浓度与理论响应（根据校准数据预测）之间百分比偏差的指标。残差范围越小，数据准确度和重现性越高。天然PFAS的残差在定量限(LOQ)下≤15%，在校准曲线的其余部分≤10%。另外，观察到同位素标记标准品的残差≤10%。样品分析过程中还进样了不同浓度的QC样品，LOQ下QC样品的准确度为20%以内，所有其他浓度为15%以内。

使用内标评估人血清基质中30种PFAS的回收率，以校正任何基质效应。图5展示了六个不同批次的混合人血清（加标浓度范围为0.1~10 ng/mL）中各种化合物的回收率。

除C4磺酰胺(FBSA)外，所有其他化合物的回收率均在可接受范围(85~120%)内。FBSA的回收率约20%，这是因为该化合物的分子量低，中性PFAS化合物可能不适合多残留提取方法。该化合物也没有合适的内标可用于校正同位素稀释。FBSA的回收率虽低，但仍然可以检出，因此能够鉴定其是否存在于样品中。如果一定要提高该化合物的回收率，可以稍微修改SPE程序。例如，可以取消使用1:3乙腈:水进行二次SPE板清洗，以回收更多的FBSA。另外，如果仅关注中性PFAS化合物，可以利用Oasis HLB等反相填料代替WAX。但是，这将影响离子型PFAS化合物的性能和回收率。

除回收率以外，研究还使用了NIST标准参考物质(SRM)持续评估方法性能。将未加标人血清NIST SRM 1957的重复样品与每批样品一起萃取，确保获得一致、准确的结果。该参考物质包含混合人血清中天然存在的七种PFAS，浓度认定值范围为0.172~21.1 µg/kg（或0.043~5.27 ng/L）。由于该SRM涵盖万亿分之一(ppt)至十亿分之一(ppb)的浓度范围，因此在方法性能测试方面非常耐用。方法的准确度和耐用性结果如图6所示。柱状图并列比较了8个SRM 1957提取和分析重复样的实验计算浓度与NIST认定值。散点图展示了实验结果与认定范围的百分比差异，所有实测值均在认定值±10%的范围内。只有PFOS的实验结果一直高于认定值，这很可能是因为数据处理过程中支化和直链异构体的处理方式不同。此外，8个重复样品的RSD百分比均低于4%，表明样品萃取和分析非常稳定。

样品分析

利用上文所述方法测定六个不同批次混合人血清中的PFAS浓度，该样品为不同性别、年龄、种族的人血清混合物。所有六个批次中的PFAS浓度均为可鉴定水平。图7所示为6个被测批次里其中3个被测批次中鉴定出的主要PFAS示例，展示了鉴定出的单个PFAS、总PFAS含量以及各PFAS占总PFAS含量的比率。虽然在所有批次的人血清中鉴定出非常相似的PFAS，但其浓度截然不同。每个批次中各PFAS占总PFAS的比率也有所不同。此外，在人血清样品中检测到的支化异构体与直链异构体比率（图8）与分析标准品中的比率明显不同。支化异构体与直链异构体的比率可以指示PFAS的合成机理。将异构体比率与单个PFAS鉴定结果相结合，创建“PFAS指纹图谱”，可能有助于了解暴露途径或来源。

使用Oasis WAX µElution 96孔SPE板优化了一种从人血清中提取PFAS的耐用方法。该方法针对30种与人体暴露有关的一系列PFAS进行了优化，这些化合物涵盖各种PFAS类别。分析采用与ACQUITY UPLC I-Class PLUS系统联用的Xevo TQ-S micro完成，该系统已使用PFAS方法包组件进行改良，旨在获得准确可靠的结果。对血清等复杂基质进行样品前处理，不仅可以更轻松地检测目标PFAS分析物，还可以减少仪器维护，延长仪器正常运行时间。使用NIST标准参考物质1957评估了方法性能，并证实了方法准确度。该方法可以应用于各类实验室，以了解血清样品中PFAS的浓度和趋势，用于职业健康监测、了解人体暴露水平、来源指纹图谱分析、暴露途径以及基于地区和/或流行病学差异了解对人类的影响等目的。

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