• 应用纪要

剖析新型冠状病毒病(COVID-19)：
尽可能拓宽以多反应监测技术进行的SARS-CoV-2分析中LC-MS检测的动态范围

剖析新型冠状病毒病(COVID-19)：
尽可能拓宽以多反应监测技术进行的SARS-CoV-2分析中LC-MS检测的动态范围
  • Laurence Van Oudenhove
  • Jan Claereboudt
  • Rowan Moore
  • Hans Vissers
  • Bart Van Puyvelde
  • Simon Daled
  • Dieter Deforce
  • Katleen Van Uytfanghe
  • Steve Silvester
  • Sally Hannam
  • Donald Jones
  • Dan Lane
  • Pankaj Gupta
  • Leong Ng
  • Maarten Dhaenens
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仅供研究使用，不适用于诊断。

摘要

靶向MS法有望从各种类型的COVID-19患者生物基质中特异性检出SARS-CoV-2蛋白。本文旨在论证精心选择的填料与消耗品组合与ACQUITY UPLC I-Class PLUS系统和Xevo TQ-XS串联四极杆质谱仪配合使用能够对鼻咽拭子（使用病毒采样管保存）中的SARS-CoV-2蛋白实现检出和定量。该方法在重组突刺糖蛋白和核蛋白的5个含量水平下均获得了线性响应（每个肽段至少使用两个通道），同时在检测的动态范围内可保持良好的重现性。

优势

  • 通过优化消耗品和MRM选择尽可能拓宽定量分析的动态范围
  • 可对鼻咽拭子中的SARS-CoV-2蛋白实现基于特征性肽段的定量分析

简介

由SARS-CoV-2病毒引起的新型冠状病毒病(COVID-19)正在全球流行。本次疫情爆发刺激科研人员着力开发高通量靶向蛋白质组学方法，意在直接检测临床呼吸道样本（例如鼻咽拭子和含漱液）中的SARS-CoV-2蛋白，作为聚合酶链式反应(PCR)检测的替代或补充方法。每个病毒颗粒中有许多不同的病毒蛋白，其拷贝数也各不相同1,2。 重组突刺糖蛋白(SPIKE)和核蛋白(NCAP)是SARS-CoV-2病毒颗粒的两种主要蛋白质成分，和其他冠状病毒一样3均是致使病毒颗粒质量数中蛋白质百分数升高的原因，本研究将其酶解并加标至健康受试者样本的鼻咽拭子中，然后使用病毒采样管(Universal Transport Medium, UTM)保存，并采用基于特征性肽段的方式进行定量，此定量分析方法属于业界协作开发的“一种可普遍采用的冠状病毒多反应监测分析方法”的组成部分4。

实验

LC条件

LC系统：

ACQUITY UPLC I-Class PLUS

样品瓶：

采用MaxPeak HPS技术的QuanRecovery样品瓶

色谱柱：

ACQUITY PREMIER BEH C18 300 Å, 2.1 mm x 50 mm, 1.7 µm肽分析专用柱

柱温：

40 ˚C

样品温度：

10 ˚C

进样体积：

5 µL

流速：

0.6 mL/min

流动相A：

0.1%甲酸水溶液

流动相B：

0.1%甲酸的乙腈溶液

MS条件

MS系统：

Xevo TQ-XS

电离模式：

ESI+

采集模式：

MRM

毛细管电压：

0.5 kV

碰撞能量：

经过肽段/通道优化

锥孔电压：

35 V

梯度

时间(min)

溶剂B (%)

0.0

5

5.5

33

5.6

85

7.0

85

7.1

5

8.0

5

数据管理

软件：

MassLynx

TargetLynx

Skyline

结果与讨论

图1例证了多反应监测(MRM)方法的通量和色谱性能，表明SPIKE_SARS2和NCAP_SARS2目标肽的分离与流出可在5.5 min的色谱窗口内完成，该方法对每个肽段使用两个通道，旨在尽可能增加占空比和信噪比，具体方法说明请参见“剖析新型冠状病毒病(COVID-19)：基于LC-MS的SARS-CoV-2检测中多反应监测通道的选择和优化策略”(720006967ZH)。典型的基线峰宽为4~6 s，LC-MS MRM方法的总运行周期（含进样）在9 min内。 

图1.P0DTC2|SPIKE_SARS2和P0DTC9|NCAP_SARS2定量分析的选定MRM色谱图汇总。两张彩色标记MRM色谱图的定量响应详见图3和4。

借助精选消耗品（即样品瓶/SPE收集板和色谱柱填料）以及重悬溶剂组成大幅提升定量响应。上述组成要素的累加效果见图2下半部，其中展示了采用Cov-MS原创标准操作程序(SOP)获得的平均基本水平MRM响应，以及通过样品瓶选择(+15%)、重悬溶剂组成(+20%)和色谱柱填料(+10%)额外获得的信号，共使信号响应提升大约55%。各加标水平的通道CV%示例值见图2上半部，结果表明该方法具有良好的重现性和稳定性。

图2.采用特定消耗品和/或溶剂进行肽分析后得到递增的MRM信号（下图）以及平均CV%（MRM重现性）随SFIEDLLFNK（来自P0DTC2|SPIKE_SARS2）加标量的变化（上图；* = 已排除离群数据）。样品制备按照Cov-MS SOP4执行，其中规定先用250 μL UTM基质溶解重组SARS2蛋白，然后使用50 μL溶剂重悬，再进样5 μL。

图3显示了SFIEDLLFNK（来自P0DTC2|SPIKE_SARS2，上图）和NPANNAAIVLQLPQGTTLPK（来自P0DTC9|NCAP_SARS2）这两种肽段的表征定量图，均覆盖5个UTM基质中的SARS-CoV-2蛋白酶解物加标水平，结果表明该方法具有良好的线性，R2值≥ 0.998，残差小于15%。NPANNAAIVLQLPQGTTLPK检测可使用单个MRM通道进一步扩展额外的样品加标水平（1 ng，相当于0.088 fmol NCAP/µL UTM基质溶液，假设UTM基质中重组NCAP与SPIKE等量），但本研究未对其做进一步研究。在无UTM基质的情况下观察到检测下限(LLOD)显著降低，这表明方法的动态范围主要受限于基质，因此提倡使用替代拭子类型并且/或者开发更加有效的净化/富集技术以进一步强化分析方法。

图3.SFIEDLLFNK（来自P0DTC2|SPIKE_SARS2，上图）和NPANNAAIVLQLPQGTTLPK（来自P0DTC9|NCAP_SARS2）的定量分析结果，表明该方法在两种目标蛋白的5个含量水平下均获得了良好的线性响应（每个肽段至少采用2个通道）。图中分别显示了SFIEDLLFNK最低加标水平(5 ng)和NPANNAAIVLQLPQGTTLPK最高加标水平(500 ng)下各通道的MRM色谱图。

半定量结果汇总见图4，表明最终MRM方法可以在至少3个加标水平下检出全部目标肽段。在两种蛋白质的全部肽段范围内，可检出加标水平的平均数量为4个，其中部分肽段的可鉴定加标水平数量可达到5个。在UTM基质中，两种蛋白质SPIKE_SARS2和NCAP_SARS2的可鉴定加标水平均可达到5 ng。

图4.UTM基质中SPIKE_SARS2（橙色）和NCAP_SARS2（蓝色）检测的定量结果汇总，表明重组SARS-CoV-2蛋白的可检出加标水平数量的平均值为4个。

结论

使用LC-MS技术对COVID-19研究进行MRM实验的临床研究和开发需要对方法进行全面分析表征。LC-MS技术的关键点具体包括：专属性、定量动态范围和方法稳定性/重现性。与新型冠状病毒相关的分析难题已通过精选的LC-MS消耗品得到解决，这样可优化线性动态范围、减少非特异性结合，在应用专属MRM通道的同时保持方法通量、提供可重现的MRM测定结果以及改善LLOD。所开发的MRM方法已成功在Xevo TQ-XS串联四极杆质谱仪上应用和评价，结果表明该方法可对鼻咽拭子（使用病毒采样管保存）中的SARS-CoV-2蛋白实现检出和定量。

参考文献

  1. JM Parks and JC Smith.How to Discover Antiviral Drugs Quickly.N Engl J Med.2020 Jun 4;382(23):2261-2264.doi: 10.1056/NEJMcibr2007042.
  2. K Bezstarosti, MM.Lamers, BL Haagmans, JAA Demmers.Targeted Proteomics for the Detection of SARS-CoV-2 Proteins, https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.04.23.057810v1
  3. M Surjit and SK.Lal.“The Nucleocapsid Protein of the SARS Coronavirus: Structure, Function and Therapeutic Potential.”Molecular Biology of the SARS-Coronavirus 129–151.22 Jul. 2009.
  4. M Dhaenens et al.http://genesis.ugent.be/uvpublicdata/Cov-MS_launch.mp4 and https://www.youtube.com/watch?v=-yV8WJAr1Lc&t=2724s

致谢

感谢Cov-MS联盟在SARS-Cov-2 MRM方法设计的业界通力协作内容中提供评价试剂盒。

Laurence Van Oudenhove、Jan Claereboudt、Rowan Moore和Hans Vissers（沃特世公司）；Bart Van Puyvelde、Simon Daled、Dieter Deforce和Maarten Dhaenens（根特大学医药生物技术实验室）；Katleen Van Uytfanghe（根特大学生物分析系）；Steve Silvester和Sally Hannam (Alderley Analytical)；Donald Jones、Dan Lane、Pankaj Gupta和Leong Ng（van Geest MS-Omics实验室和莱斯特大学医学与化学病理学系）。

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720006968ZH，2020年8月

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