• 应用纪要

阴离子交换色谱法测定腺相关病毒中空衣壳和完整衣壳的含量

阴离子交换色谱法测定腺相关病毒中空衣壳和完整衣壳的含量
  • Hua Yang
  • Stephan M. Koza
  • Weibin Chen
  • Waters Corporation
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摘要

本应用纪要展示了在Waters Protein-Pak Hi Res Q AEX色谱柱上分离和定量空衣壳和完整衣壳的应用。

优势

  • 使用Protein-Pak Hi Res Q色谱柱分离和定量AAV空衣壳和完整衣壳
  • AEX法分离AAV空衣壳和完整衣壳的方法开发
  • AEX法鉴定AAV血清型

简介

重组腺相关病毒(AAV)载体已越来越多地用作基因疗法中传递治疗性基因的载体1。 在AAV的生物制造工艺中，还会产生大量空衣壳，这些衣壳不含所需的DNA，因此不具备治疗作用。有研究称，空衣壳会降低转导效率并诱发不必要的免疫应答2。 另一方面，最近有数据表明AAV空衣壳可以增强基因转移3。无论空衣壳是有益还是有害，都有必要监测它和完整衣壳的配比，确保产品质量和疗效保持一致。

目前已有多种技术被应用于定量AAV样品中的空衣壳。分析型超速离心(AUC)4、紫外分光光度法5和电子显微镜6,7是广泛用于测量AAV颗粒空衣壳/完整衣壳比(empty/full ratio)的技术。AUC可测量颗粒沉降速率，是该应用领域的黄金标准。但是，AUC方法需要专业分析人员花费数小时来解析数据，而且部署AUC仪器会消耗数百微升的宝贵样品。此外，基于AUC的分析方法很难验证。另一种方法是使用静态分光光度法在260 nm与280 nm处测量，大致区分空衣壳和完整衣壳。这种方法虽然速度较快，但结果准确度可能受样品基质干扰物的影响。此外，需要使用大量样品才能获得足够高的吸光度值。透射电子显微镜(TEM)和低温电子显微镜(Cryo-EM)可直接将空衣壳颗粒和完整衣壳颗粒可视化并进行计数，但这种定量方法很大程度上依赖于图像质量和视野选择。电荷检测质谱(CDMS)法是最近用于此分析的一项技术8。这种MS方法可直接测量颗粒的分子量，已被证明能够准确测量AAV空衣壳、部分衣壳和完整衣壳颗粒。目前还没有商用CDMS仪器。

阴离子交换色谱(AEX)法据称具有分离空衣壳和完整衣壳的潜力，并且有研究表明，这种分离是由相对表面电荷的差异驱动的9,10。 该技术消耗的样品量小，使用标准LC仪器即可产生稳定且可重现的结果。本应用纪要展示了在Waters Protein-Pak Hi Res Q AEX色谱柱上分离和定量空衣壳和完整衣壳的应用。

实验

样品描述

将包含填充衣壳（完整）或空衣壳（空，没有绿色荧光蛋白[GFP]基因）的AAV8样品直接注入阴离子交换柱，无需稀释。完整AAV8衣壳的浓度为8.5 E12 vg/mL，空衣壳的浓度为1.67 E12衣壳/mL。样品由美国马里兰州罗克维尔的BioReliance Corporation提供。

在一组单独的样品中，AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV8、AAV9均以完整衣壳的形式提供，内含GFP基因（Vigene Biosciences，美国马里兰州罗克维尔）。所有样品均直接注入阴离子交换柱，无需稀释。样品浓度范围为1.3 × 1013~6.7 × 1013 GC/mL。

液相色谱条件

系统：

ACQUITY UPLC H-Class Bio

样品温度：

10 °C

分析柱柱温：

30 °C

流速：

0.35 mL/min或0.4 mL/min

进样体积：

0.2-6 μL

色谱柱：

Protein-Pak Hi Res Q, 5 µm, 4.6×100 mm（部件号：186004931）

检测：

荧光检测器：激发波长280 nm，发射波长350 nm；

配备5 mm钛流通池的ACQUITY UPLC TUV检测器，双波长：280 nm和260 nm

样品瓶：

聚丙烯材质12×32 mm螺纹口样品瓶，带瓶盖和预切割PTFE/硅胶隔垫，容积300 µL（部件号：186002639）

Auto•Blend Plus方法

流动相A：

100 mM Tris-HCl

流动相B：

100 mM Tris碱

流动相C：

1 M盐（请参阅文字和图片）

流动相D：

水
*盐浓度因具体条件而异。

四元泵混合方法

流动相A：

250 mM双三羟基甲氨基丙烷，pH 9或10

流动相B：

20 mM MgCl2

流动相C：

1 M四甲基氯化铵

流动相D：

水

数据管理：

Empower 3 (FR 4)
**在某些情况下，使用10% B (2 mM Mg2+)。

结果与讨论

在Protein-Pak Hi Res Q色谱柱上使用上述梯度方法分离AAV8空衣壳和完整衣壳混合物（图1）。与先前报道的结果一致9,10，在强阴离子交换柱上，完整衣壳比空衣壳晚洗脱，表明完整衣壳携带的阴离子电荷比空衣壳多，这可能是因为它们包裹的DNA导致的。

图1.在Protein-Pak Hi Res Q色谱柱上分离AAV8空衣壳和完整衣壳混合物。20 mM Tris pH 9，NaCl在20 min内从0增加至300 mM，流速0.4 mL/min。a–c)进样6 μL。a) 260 nm处的TUV。b) 280 nm处的TUV。c)荧光检测：激发波长280 nm，发射波长350 nm。d)进样0.5 μL的荧光检测结果。20 mM Tris pH 9，NaCl在20 min内从50增加至250 mM，流速0.4 mL/min。

图1a和1b分别显示了260 nm和280 nm处的UV检测结果。与文献9所述一致，完整衣壳在260 nm处的峰面积大于280 nm处的峰面积；而空衣壳在260 nm处的峰面积小于280 nm处的峰面积。这是因为，在280 nm处，衣壳蛋白的吸光度高于DNA，而在260 nm处，病毒DNA的吸光度高于衣壳蛋白。

图1c所示为采用相同分离方法得到的荧光检测信号，可以看到，荧光信号远高于UV检测信号，与之前报告的结果一致9。 即使进样体积只有0.5 μL（柱上载样量约4*109 vg），信号也远高于检测限（图1d）。因此，本应用纪要的剩余部分仅展示荧光检测数据。

在空衣壳和完整衣壳之间洗脱的中间峰（图1c，峰I）似乎存在于空衣壳样品中；电子显微镜数据测得空衣壳样品中完整衣壳含量为0.5%，也可以据此推测该峰主要是空衣壳。此外，中间峰的A260/A280 UV比率与在空衣壳峰中观察到的值一致（数据未显示）。基于这些结果，没有实质性证据表明中间峰代表含有部分DNA含量的衣壳。假设AAV8衣壳的一级结构或构象变化引起的蛋白质电荷异质性对AEX分离的影响程度与ssDNA含量几乎相同。NaCl浓度较高也可能导致空衣壳的构象或结构变化，进而导致表面电荷发生变化。这些结果与此前发表的AAV-AEX纯化结果一致，即，在几种血清型的AEX洗脱过程中观察到AAV空衣壳、完整衣壳和部分完整的衣壳11。

在AEX上分离空衣壳和完整衣壳的方法开发

虽然初始条件表明Protein-Pak Hi Res Q色谱柱能够有效分离空衣壳和完整衣壳，但我们仍进行了方法开发以进一步优化和评价分离的稳定性。

缓冲液pH值、盐类型、缓冲液类型和镁离子浓度的影响

优化时首先考虑的参数通常是流动相pH。初始测试表明，pH 9的Tris缓冲液相比pH 8.5的缓冲液能够更好地分离完整衣壳/空衣壳（数据未显示）。

图2显示了在Tris缓冲液(pH 9)中使用不同类型的盐分离空衣壳和完整衣壳的色谱图。使用不同类型的盐获得了不同的保留时间，空衣壳和完整衣壳之间的分离度也不相同。空衣壳/完整衣壳比也有所不同，这可能是由于空衣壳和完整衣壳之间的分离度不同导致的。在测试的所有盐中，使用四甲基氯化铵时空衣壳和完整衣壳之间的分离度最佳。

图2.使用各种类型的盐分离AAV8空衣壳和完整衣壳混合物。20 mM Tris pH 9，20分钟盐梯度，流速0.4 mL/min。

测试Tris缓冲液和双三羟基甲氨基丙烷缓冲液在pH 9下对分离的影响。两种条件都有效分离了空衣壳和完整衣壳，双三羟基甲氨基丙烷的分离度稍好，基线稳定性更好（数据未显示）。

当使用双三羟基甲氨基丙烷缓冲液比较pH 9和pH 10下的分离时，pH 9产生了更好的分离结果（图3）。

图3.pH值对AAV8空衣壳和完整衣壳分离的影响。a) 70 mM双三羟基甲氨基丙烷pH 9，2 mM Mg2+，四甲基氯化铵在25 min内从80增至280 mM，流速0.35 mL/min。b) 70 mM双三羟基甲氨基丙烷pH 10，2 mM Mg2+，四甲基氯化铵在25 min内从200增至400 mM，流速0.35 mL/min。

有研究表明，在AEX流动相中添加2 mM镁(Mg2+)可改善不同种类AAV的峰形10，但在本应用纪要评估的条件下，在流动相中添加Mg2+（图4）并未改善AAV8-GFP的分离结果。不过，添加低水平镁离子的做法仍然值得考虑，它在其他AAV血清型的分离中可能有效。

图4.Mg2+对AAV8空衣壳和完整衣壳分离的影响。70 mM双三羟基甲氨基丙烷pH 9，四甲基氯化铵在25 min内从80增至280 mM，流速0.35 mL/min。

AEX法分析空衣壳

使用优化方法分离空衣壳与完整衣壳的结果见图5，图6显示了具有不同空衣壳/完整衣壳比的AAV8样品的一系列色谱图。

图5.使用优化的AEX方法分离AAV8空衣壳和完整衣壳：70 mM双三羟基甲氨基丙烷pH 9，四甲基氯化铵在20 min内从100增至300 mM，流速0.4 mL/min。
图6.使用优化的AEX方法定量各种AAV8空衣壳和完整衣壳混合物中的空衣壳百分比。

我们将主要由空衣壳或完整衣壳组成的两个标样以不同体积混合，得到一系列评价样品，分析数据见图6。为确保制得的混合物具有适当的浓度和比例，采用体积排阻色谱(SEC)法结合内在蛋白荧光(FLR)检测对AAV空衣壳和完整衣壳样品的衣壳浓度进行归一化（数据未显示）。这种浓度归一化是基于AAV空衣壳和完整衣壳标样测得的峰面积实现的，假设这些标样为纯品，功能正常，并且接受完整衣壳和空衣壳之间的FLR响应因子为1.310。 该响应因子是先前在AAV6血清型中报告的，考虑到衣壳蛋白同源性，故被用作AAV8衣壳的合理估计值。尽管我们认为该近似值足以满足本研究的演示目的，但必须指出的是，在方法开发过程中必须尽职尽责地考虑分配AAV空衣壳和完整衣壳标样的纯度和含量。

总而言之，图6证明，这种优化的AEX分离方法可监测AAV8样品中的空衣壳/完整衣壳比。图6还显示了响应的线性。分别排除在大约16分钟（绿色迹线）和12分钟（黑色迹线）达到顶点的小峰面积后，测量了空衣壳标样和完整衣壳标样的峰面积，得到此响应曲线。使用完整衣壳与空衣壳的实测峰面积之比确定相对FLR响应因子(RFF/E)为1.9。然后用完整衣壳峰的峰面积除以该值，将完整衣壳峰的响应值相对于空衣壳峰的响应值进行归一化，再用公式1计算空衣壳和完整衣壳的相对丰度。

公式1

此处确定的AEX响应因子(1.9)与在SEC-FLR法中观察到的响应因子(1.3)之间的差异可能是由于各实验中使用的流动相和柱温不同引起的，这进一步强调了在确立AAV样品中空衣壳和完整衣壳的相对丰度时，确定二者特定FLR响应因子的重要性。

AEX对不同AAV血清型的效果

在Protein-Pak Hi Res Q色谱柱上以相同的分离条件单独运行了几种AAV血清型样品（图7）。为便于比较，还在图7a（底部色谱图）中加入了具有空衣壳和完整衣壳的AAV8样品的色谱图。AAV8在上述方法开发工作之后实现了分离。如图所示，不同AAV血清型的AAV衣壳的保留时间也不同。虽然AAV2、AAV5和AAV8几乎同时洗脱，但AAV1和AAV6较晚洗脱，AAV9较早洗脱（图7a）。降低起始梯度的盐浓度后，AAV9在色谱柱上的保留性更好（图7b）。

图7.a) Protein-Pak Hi Res Q色谱柱上各种AAV血清型（完整衣壳）的色谱图。为便于比较，底部色谱图显示了在之前的方法开发中分离的AAV8空衣壳和完整衣壳。70 mM双三羟基甲氨基丙烷pH 9，四甲基氯化铵在20 min内从100增至300 mM，流速0.4 mL/min。b) 降低初始盐浓度后，AAV9在色谱柱上的保留性更好。70 mM双三羟基甲氨基丙烷pH 9，四甲基氯化铵在20 min内从0增至200 mM，流速0.4 mL/min。

上述结果表明可能需要进一步开发方法来分离不同AAV血清型的空衣壳和完整衣壳。由于未获得这些血清型的空衣壳，本研究没有对此进行评估。不过，由于这些血清型的峰形与AAV8非常相似，因此当前优化的AEX方法应作为其他AAV血清型AEX方法开发的有用起点。

结论

评价空衣壳和完整衣壳的含量非常重要，有助于确保产品质量以及确定药物的适当剂量。

本研究证明，使用Waters Protein-Pak Hi Res Q色谱柱，经过适当的方法开发，可以分离AAV8空衣壳和完整衣壳并测定相对丰度。

由于衣壳蛋白表面的差异，在分离其他AAV血清型的空衣壳和完整衣壳时，可能需要进行方法评价和一些方法优化，本应用纪要中的AEX方法可以作为一个有用的起点。

参考资料

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