合相色谱初学者指南

如前文所述，合相色谱的选择性非常广泛，适用于多种应用（表5）。

无论在哪个市场领域，也无论目标分析物的具体性质如何，CC都能从以下三个重要方面协助分析人员应对分析挑战：

• 合相色谱可简化工作流程
• 合相色谱可分离结构相似化合物
• 合相色谱是反相LC的正交分离模式

接下来的内容将通过一些应用示例详细介绍CC的主要优势。

在SFC到CC的演进过程中，最有用的发现之一是压缩CO₂可与各类有机溶剂混合，因此我们能够以全新的方式进行色谱分析。本节将介绍CC如何大幅简化分析实验的工作流程。

对于所有分析实验室而言，从最初的样品采集到最后的分析，任何环节的工作流程简化都会对业务产生巨大影响。CC能够大幅简化许多应用的工作流程，有效节省成本和时间、降低出错率并提高工作效率。上述简化体现在以下方面：

• 结合多项技术（LC和GC）
• 结合多种方法（正相LC和反相LC）
• 缩短样品制备时间

结合多项技术 - 脂质分析

出于诸多原因，脂质分析意义重大。在制药行业中，人们借助脂质分析来确定对照组和给药组受试者体内的药效影响。

在临床研究中，脂质可作为不同疾病的生物标志物，还可衡量治疗的疗效。食品应用则通过分析特定种类的脂质（如甘油三酸酯）来评价食物营养水平或辨别产品真伪。化工原料行业涉及到分析石油产品（例如生物柴油）中的脂肪酸和甘油三酸酯。根据预期目标，脂质分析需要采用不同的技术。人们通常采用GC来分析游离脂肪酸，使用该方法时需要将游离脂肪酸（尤其是长碳链脂肪酸）衍生为脂肪酸甲酯(FAME)以改善峰形和检测限。衍生化步骤需要花费数小时，而且随后的GC分析耗时长达30 min。在分析磷脂和鞘脂类等强极性脂质时，通常需使用HILIC或正相LC来分离不同种类的脂质（基于其极性头部基团的性质）。然后，根据碳链长度和/或双键数量的差异，使用反相LC分析同种类的强疏水性脂质。由此可见，全面的脂质分析要用到多项技术。但CC可以解决这一问题，通过此项技术只需一次进样即可分离所有种类的脂质。图40所示为采用ACQUITY UPC²系统分析小鼠心脏提取物得到的脂质综合分析谱图。在本例中，我们使用BEH色谱柱和通用梯度成功分离了不同种类的脂质，所得分离结果与正相LC或HILIC的结果相当。

对于中性脂质（如三酰甘油(TG)、甘油二酯(DG)、胆固醇酯(CE)以及游离脂肪酸），只需改变色谱柱和梯度条件即可根据脂肪酸碳链长度以及双键数量的差异保留和分离同一种类中的不同脂质（图41）。

在本应用中，CC不仅比GC分析速度更快（速度提升多达10倍），而且无需衍生化步骤，因此可大幅简化整个脂质分析工作流程。省去衍生化步骤可缩短分析时间，还能大幅减少在工作流程中增加这些额外步骤时可能引入的错误。如果不使用CC，此类分析和靶向分析需要使用多达三种不同的技术，导致样品通量低、溶剂用量大、运行时间长，整体分析成本也更高。

结合多种LC方法 - 脂溶性维生素

脂溶性维生素分析在制药行业、临床研究和诊断，以及食品和燃料行业中具有十分重要的意义。人们通常使用反相或正相LC分析脂溶性维生素和类胡萝卜素（表6）。由于这些化合物难以通过单次进样实现分离，一般需要使用不同的色谱柱和流动相对它们进行单独分析，分析时间为10~30 min。相比而言，CC在10 min之内即可完成所有维生素和相关化合物的分析（图42）。与表6中所列的传统分析方法不同，经简化的CC方法只需使用一种色谱柱、一种流动相条件以及一种检测器。CC可直接进样提取或溶解目标化合物时常用的溶剂（例如异辛烷和正己烷），而无需进行反相分析中通常必须执行的溶剂交换步骤。

缩短样品制备时间

除了可将多种技术和方法相结合，以更快的速度分离分析物之外，CC通常还能缩短样品制备时间。CC兼容有机溶剂，因此拥有以下优势：

• 无需水解和/或衍生化步骤
• 无需通过蒸发和复溶进行溶剂交换
• 操作步骤少，可有效减少实验误差和提高数据质量

以分析食品中的脂溶性维生素为例，需要执行多个样品制备步骤和多次分析。图43所示为食品中维生素A、D和E的典型样品工作流程。由图可见，维生素A和E的样品制备步骤与维生素D不同。另外，需要对这三种维生素进行三次独立的HPLC（正相和反相）分析。维生素D的样品制备过程尤其复杂，其中包含多个步骤，在某些情况下还包括半制备型HPLC分离步骤。

使用CC分析相同维生素的样品制备步骤要简单得多（图44），因为该技术兼容提取过程前期使用的非极性有机溶剂。在本例中，我们直接进样经己烷提取的样品即可定量分析维生素E，然后对样品进行浓缩之后分析维生素A和D3，这样就使得运行时间比传统分析方法缩短了20倍。另外，CC只需三个样品制备步骤、一种方法以及一台仪器，而图43所示的传统工作流程包括12个样品制备步骤、三种方法，还需使用两台不同的仪器。表7总结了CC用于上述应用的优势，并列出了该技术还可在哪些其他领域让分析科学家受益于如上所述的精简分析流程。

快速分离结构相似化合物

由于具有结构相似性，异构体和结构类似物（尤其是光学异构体）有时很难实现分离。接下来我们将讨论CC在分离以下结构相似化合物中的应用：

• 手性分离（对映体和非对映体）
• 位置异构体（官能团位置不同）
• 结构类似物
  • 生物标志物（共轭/非共轭）
  • 药物（代谢物、杂质、降解产物）

化合物的不同对映体通常具有不同的功效和毒性特征，因此在研究、开发和生产阶段须对其进行监测。人们主要使用纤维素或直链淀粉基固定相通过正相LC进行手性分离。在正相LC中，梯度分离难以实施。分析人员必须使用不同的流动相组合（通常需要毒性很强的溶剂）和不同的色谱柱进行多次等度分析，因此方法开发过程相当耗时。CC能够运行梯度分析，而且选择性范围非常广泛，只需使用无毒的溶剂，借助该技术，分析科学家们在一天之内即可开发出手性分离方法。

多年以前，纯化化学家们就已经认识到了SFC在手性分离中的应用价值。尽管分析型SFC分离的准确度欠佳，但对于快速手性筛选、手性方法开发、对映体过量转化（e.e值）测定和手性转化研究而言是非常理想的。与正相LC不同，CC与质谱检测高度兼容，因此能够鉴定并表征反应、生产过程以及生物系统中的对映体及其构型（图45）。

图46对比了华法林对映体在正相和合相色谱上的分离情况。与正相色谱相比，CC在短时间内就实现了对映体的基线分离（比正相色谱快30倍）。另外，由于无需使用购买和处理成本都很高的有毒溶剂，CC将每次手性分离的分析成本降低了多达100倍。得益于这些优势，CC技术已经成为各种手性分析的理想之选。

位置异构体和结构类似物

CC在位置异构体和其他结构类似物的分离中非常有用。位置异构体是分子量相同（同量异位）但官能团位置不同的一类化合物。涉及原料分析、反应监测以及不对称催化的应用中常常出现这类化合物。为了分离异构体，这些化合物在GC分析前一般都需要进行衍生化。正相LC方法有稳定性欠佳、分析速度慢的固有缺陷。另一方面，具有选择性优势的CC分离方法在通用条件下就能轻松分离位置异构体，且无需衍生化步骤。

ACQUITY UPC²系统（图47）可快速分离异构体，有助于实时评估反应原料、中间体和最终产品的优化效果。结构类似物因其具有相似的结构因此难以分离，此类物质包括共轭或非共轭的生物标志物（例如葡糖苷酸、硫酸盐）以及药物化合物的代谢物、降解产物和杂质。类固醇是最常见的一类结构类似物（图48）。不同类固醇的结构相似，由于其质量数差异非常小，即使采用MS检测也很难对它们进行分离和分析。采用CC，在多种色谱柱上应用通用筛查梯度都能在2 min内轻松分离这些化合物（图49）。由于此类化合物的非极性特点，此类分离对反相LC而言非常棘手，而GC方法则需要进行衍生化以改善峰形和检测限。ACQUITY UPC²系统与MS检测联用是鉴定和定量类固醇的一种优良方法。

分离共轭结构类似物的难度更大。游离类固醇（图48）不溶于水，进入人体后会转化成硫酸化的水溶性衍生物。这个过程会生成带负电荷的亲水性侧基，使它们可溶于水（图50）。人们从天然原料中分离出这类化合物用于疾病治疗，在疾病研究和疗效评估中，它们被用作生物标志物。这些化合物的分析面临两个主要挑战。

首先，GC分析耗时30 min，而且样品制备过程包括硫酸基团的酶水解及后续的衍生化步骤，耗时2.5 h。其次，由于某些雌激素是同量异位化合物（m/z相同），质谱无法区分它们。因此，需要借助色谱法分离不同形式的同量异位化合物。

CC可在15 min内分离所有10种硫酸化雌激素（图51），其中包括两个邻近洗脱峰（峰6和7），而采用30 min的GC分析方法时，这两个峰难以分离（图52）。由于CC能够分析硫酸化化合物的原本形式，因而样品无需进行水解和衍生化。这样一来大大减少治疗制剂的分析步骤，因此通量和效率得以提升。

表8总结了CC用于上述应用时的优势，同时给出了适合采用该技术分离对映体、位置异构体以及结构类似物的其他应用领域。

正交性

正交分离模式彼此互补，但各自又以其独有的方式实现峰保留，因此获得的样品信息比单一分离模式更丰富。拥有采用不同技术分离分析物的能力至关重要，原因如下：

• 有助于可靠地鉴定和表征杂质、降解峰或相似化合物（例如同量异位化合物或共洗脱化合物）
• 确保样品得到全面表征
• 能够获得更丰富的样品信息
• 有助于从基质干扰中分离目标化合物

正交分离技术的例子包括互补模式，例如正相和反相色谱。CC的选择性与正相色谱类似，但它比任何正相方法都更加稳定可靠（请参阅第2章），而且重现性更好。接下来的内容将展示以CC作为正交分离模式实现上述目标的示例。

使用ACQUITY UPLC和ACQUITY UPC²系统分离活性药物成分（甲氧氯普胺）及其相关物质所得的结果证明了合相色谱的正交性（图53）。采用某种技术无法分离的峰可以借助另一种技术实现分离，反之亦然。CC对极性化合物（例如峰1和2）的保留时间比RPLC更长。在本例中，ACQUITY UPC²系统成功分离了关键分析物对（峰5和甲氧氯普胺），这有助于我们进行更大规模的纯化和分离，用于后续的鉴定和表征。所有这些优势使得CC尤其适合与其他常规技术并行使用，以协助解决各种分离难题。

在分离目标分析物与基质干扰物时（例如在生物分析或食品分析中），正交方法同样发挥着重要作用。

图54A是一个典型示例，展示了使用蛋白沉淀法从人血浆中提取的氯吡格雷的LC-MS/MS谱图。氯吡格雷具有疏水性，因此在分析中的洗脱时间非常靠后。干扰物磷脂（具有含胆碱的头部基团）也在相同的时间区域内洗脱（图54B），可能会对氯吡格雷峰造成离子抑制并导致定量结果不一致。有意思的是，ACQUITY UPC²系统洗脱磷脂干扰物的时间区域与RPLC大致相同（图54C）。得益于CC与反相LC的正交性，目标分析物的洗脱时间大幅提前，与这些磷脂干扰物分离（图54D），从而尽可能降低了基质效应，确保定量结果更加准确精密。

这些优势都证明了本章前面部分所提到的CC的三个重要特性：

1. 合相色谱可简化工作流程
2. 合相色谱可分离结构相似化合物
3. 合相色谱是反相LC的正交技术

• 集多项技术于一体
• 缩短样品制备及分析时间
• 可直接进样有机溶剂/提取物

• 对映体（手性）
• 位置异构体
• 结构类似物和共轭物

• 更可靠地鉴定杂质/降解产物
• 全面表征样品
• 分离基质干扰与目标分析物