Une estimation du rendement peut être déterminée par analyse de fractions à l'aide de diverses techniques analytiques de routine telles que les techniques UV, IR, MS, RMN, l'analyse aux rayons X, le dosage et/ou l'élucidation structurale. Lorsqu'un étalon est disponible, il est facile de comparer directement l'isolat avec les données de la littérature. Cependant, si le composé cible est inconnu, une approche systématique large et exhaustive faisant intervenir diverses techniques physiques, chimiques et spectroscopiques est nécessaire pour établir un profil de pureté et de stabilité.
Équation 14 : % de rendement
Lors de l’analyse de l’isolat, si la pureté, le rendement ou l’activité ne correspondent pas à vos attentes, vérifiez si l’isolat est concerné par les situations suivantes.
- Des gradients de concentration peuvent se former lors d'un test directement depuis le récipient de collecte. Par conséquent, le résultat de pureté dépend de l'endroit d'où provient l'échantillon dans le récipient de collecte. Les échantillons doivent être bien mélangés avant l'analyse pour obtenir un résultat représentatif.
- Si l'échantillon est particulièrement soluble dans un solvant fort tel que le DMSO, mais pas dans une phase mobile, la fraction recueillie se cristallisera avec le temps lors de son stockage dans le récipient de collecte. Si la phase liquide est prélevée à des fins d'analyse de pureté et de concentration, les résultats ne seront représentatifs que de la partie soluble.
- Le composé actif peut également être perdu suite à sa décomposition entre le moment de la collecte, le test de pureté et le test d'activité. Il peut également se décomposer pendant le processus de séchage. Par conséquent, les tests d'activité sont presque toujours effectués avant et après le séchage.
- Le composé actif est retenu sur la colonne.
- Le composé actif est instable dans les conditions appliquées pour le processus d'isolement.
- La solution d'extrait peut ne pas avoir été préparée dans un solvant compatible avec la phase mobile, une précipitation peut donc s'être produite.
- La majeure partie du composé actif est répartie sur une large gamme de fractions, ce qui implique que les quantités du composé présent dans les fractions sont indétectables.
- L'activité de l'extrait peut être due à la présence d'autres composés dans l'échantillon brut et non actifs individuellement.
- L'isolat peut ne pas être aussi pur que prévu s'il a été recueilli à une longueur d'onde UV à laquelle des impuretés éluantes proches n'ont pas été absorbées.
Si l'isolat ne répond pas aux exigences de pureté, de vitesse d'analyse ou de rendement de l'application, une nouvelle purification de l'isolat peut être effectuée en utilisant la même méthode de séparation, ou une nouvelle méthode de séparation globale peut être développée avec une sélectivité de colonne différente. Il appartient au chromatographiste de déterminer le temps et les efforts qu'il souhaite consacrer à la purification afin d'atteindre les objectifs de pureté, de vitesse d'analyse et de rendement souhaités.
