Manuel d’initiation à la chromatographie d’exclusion stérique

Quelles colonnes dois-je utiliser et pourquoi ?

La sélection des colonnes est essentielle pour garantir l’obtention de la bonne distribution des masses moléculaires du polymère d’intérêt.

Facteurs initiaux à prendre en compte : la solubilité

Hydrosoluble :

• Gamme de colonnes Ultrahydrogel

Soluble organique :

• Styragel HR pour les travaux haute résolution
• Styragel HT pour les travaux à haute température
• Styragel HMW pour les polymères de masse moléculaire ultra-élevée

De quel solvant doivent être remplies les colonnes que j’achète, et pourquoi ?

Les colonnes HR, HT et HMW sont remplies au choix de :

• THF
• Toluène
• DMF

Des colonnes spéciales remplies de méthanol destinées spécifiquement aux analyses à température ambiante avec du HFIP (hexafluoro-isopropanol) sont disponibles. Si vous utilisez pour votre application un solvant autre que les quatre susmentionnés, vous devez prendre en compte quelques règles d’or. Si vous effectuez une application à « température ambiante » dans un solvant tel que le chloroforme ou le dichlorométhane, convertissez d’abord à partir de THF. Si vous prévoyez de travailler à haute température dans du TCB ou de l’ODCB, par exemple, convertissez à partir de toluène à environ 85-90 °C. Si vous comptez utiliser un solvant très polaire, comme du DMAC (diméthylacétamide) ou de la NMP (n-méthylpyrrolidone), convertissez à partir de DMF.

J’ai actuellement des colonnes de solvant « A » et je souhaite passer à un solvant « B » ?

En général, il est possible de passer directement d’un solvant à un autre à raison de 0,1 à 0,2 mL/minute (consultez le manuel d’entretien et d’utilisation de votre colonne), si les deux solvants sont miscibles. Si les solvants ne sont pas miscibles, un solvant intermédiaire (dans lequel les deux solvants sont miscibles) devra être utilisé.

Dans quel ordre dois-je placer les colonnes et pourquoi ?

En général, l’ordre dans lequel les colonnes sont placées n’a pas d’importance. L’ordre n’affectera pas les calculs de distribution des masses moléculaires du polymère d’élution. Il est toutefois recommandé de toujours placer les colonnes de 100 Å ou de 50 Å à l’extrémité du jeu, étant donné que le gel de styrène/divinylbenzène qui s’y trouve a tendance à être plus mou et moins résistant.

Quel débit dois-je utiliser dans ma colonne GPC ?

Il est recommandé de ne pas dépasser 1,0 mL/min pour des colonnes analytiques ayant un diamètre intérieur de 7,8 mm. La résolution « optimale » pour ces colonnes est d’environ 0,70 à 0,80 mL/min. Le débit optimal pour des colonnes à alésage étroit d’un diamètre intérieur de 4,6 mm est de 0,3 à 0,35 mL/min. Consultez votre manuel d’entretien et d’utilisation pour plus de détails.

Dois-je augmenter progressivement le débit et la température lors du démarrage des colonnes ?

Il est obligatoire d’augmenter progressivement le débit des colonnes analytiques GPC, en particulier celles de la série HR. Une augmentation soudaine du débit (et par conséquent de la pression) endommagera les colonnes. La montée en température n’est pas aussi critique. En général, nous faisons passer le débit de 0,0 à 1,0 mL/min sur un intervalle de 60 secondes. La température passe quant à elle de la température ambiante à 150 °C (par exemple) en l’espace de plusieurs heures.

Comment choisir la plage de tailles de pores de mes colonnes ?

La plage des tailles de pores est choisie en déterminant la plage approximative des masses moléculaires de l’échantillon d’intérêt. Si la plage des masses moléculaires est faible (résine époxy, par exemple), alors un jeu de colonnes de 103, 500, 100, voire 50 Å doit être utilisé. Si l’échantillon d’intérêt est un PVC de masse moléculaire moyenne, alors un jeu de 103, 104 et 105 Å doit être utilisé. Choisir des tailles de pores individuelles ciblant la plage de masses moléculaires du polymère permet d’obtenir la résolution la plus élevée. Si la plage de masses moléculaires est inconnue ou très large, il est recommandé d’utiliser des colonnes à lit mixte, c’est-à-dire des colonnes « linéaires » ou « à plage étendue », qui fournissent une diversité de tailles de pores.

Qu’est-ce que la résolution et quelle est la résolution appropriée ?

En analyse GPC, la résolution désigne la plage des masses moléculaires séparées en un volume incrémentiel d’élution. Ce paramètre doit être maximisé dans la mesure du possible. La façon la plus simple d’y parvenir est d’ajouter des colonnes (ce qui augmente donc le temps d’analyse, hélas). Une autre méthode consiste à utiliser des particules de faible granulométrie (environ 5 µm) afin d’augmenter l’efficacité. Le compromis ici se situe au niveau de la durabilité et de la durée de vie de la colonne. Dans les séparations impliquant des oligomères, des additifs et des distributions multimodales, la résolution peut être importante. Si l’échantillon est un polyéthylène haute densité à large distribution, la résolution ne sera peut-être pas aussi importante.

Waters fabrique des colonnes haute résolution (série HR) de 5 µm, la série HT, d’environ 10 µm (pour les travaux à haute température et impliquant des changements de solvants multiples) et la série HMW, qui comportent des particules de 20 µm. Ces colonnes conviennent aux échantillons à masse moléculaire très élevée pour lesquels le cisaillement pose problème mais où la résolution n’est pas aussi critique.

Qu’est-ce qu’un étalon « étroit » ? Qu’est-ce qu’un étalon « large » ?

• Les étalons « étroits » se rapportent aux étalons pour lesquels la polydispersité est inférieure à environ 1,10. La polydispersité se définit comme le rapport entre la masse moléculaire moyenne en poids (Mw) et la masse moléculaire moyenne en nombre (Mn).
• Les étalons « larges » ont des polydispersités supérieures à 1,10 et sont généralement constitués du même polymère que l’échantillon à analyser.

Si j’utilise des étalons « étroits », puis-je en injecter plusieurs à la fois ?

En GPC classique avec détection RI, il est tout à fait acceptable d’injecter un mélange d’étalons, tant que la résolution des étalons élués est suffisante. Nous suggérons un maximum de trois. Dans le cadre d’une détection avancée telle que la viscosimétrie, où l’aire sous la courbe pour l’étalon doit être connue avec exactitude, un seul étalon à la fois doit être injecté.

Quel(s) étalon(s) dois-je utiliser pour mon polymère ?

Pour la plupart des utilisateurs, un étalonnage « relatif » étroit convient parfaitement. Dans ce cas, des étalons de polystyrène sont habituellement choisis pour la GPC en phase organique, même si des étalons étroits de PMMA, polyisoprène, polybutadiène et polyTHF peuvent aussi être utilisés. Pour une analyse GPC en phase aqueuse, il existe des poly(oxydes d’éthylène), polyéthylènes glycols et pullulanes (polysaccharides) étroits. Si l’utilisateur a besoin de la « vraie » masse moléculaire (l’étalon n’est pas suffisamment bon), un étalon large (ou référence) de même nature chimique que les échantillons peut être utilisé.

Dans quelle mesure les étalons larges sont-ils fiables ?

Dans la plupart des cas, les étalons larges disponibles dans le commerce ont été bien caractérisés par des techniques fournissant des valeurs Mw, Mn, Mz, etc. raisonnables. Vous pouvez généralement vous fier à ces étalons, dont les valeurs rapportées sont exactes et obtenues avec une excellente précision. Après tout, votre courbe d’étalonnage est basée sur ces valeurs. Il est également possible d’envoyer un échantillon représentatif type des échantillons analysés en laboratoire afin qu’il y soit analysé par ces techniques auxiliaires. De nombreux laboratoires sous-traitants et universités peuvent effectuer ces analyses et vous fournir les valeurs Mn, Mw, Mz, etc. relatives à l’échantillon que vous souhaitez utiliser comme étalon large.

Puis-je utiliser les valeurs K et alpha du « Polymer Handbook » ?

Le concept d’étalonnage universel, qui consiste à développer un étalonnage basé sur le volume hydrodynamique logarithmique et non sur la masse moléculaire logarithmique, permet d’obtenir des masses moléculaires « absolues » pour les éléments inconnus. Un tracé de log [viscosité intrinsèque] en fonction de log [masse moléculaire] produit ce que l’on appelle le tracé de « Mark-Houwink » ou « loi de viscosité ». La pente de cette courbe est alpha, et l’ordonnée à l’origine détermine K (les constantes de Mark-Houwink). En l’absence d’un viscosimètre intégré, les constantes de Mark-Houwink peuvent être utilisées, à condition qu’elles soient bien connues non seulement pour les étalons étroits afin de développer l’étalonnage universel, mais également pour les éléments inconnus. Les valeurs indiquées dans le manuel « Polymer Handbook » doivent correspondre au bon polymère d’intérêt, dans la bonne plage de masses moléculaires, dans le solvant utilisé et à la température de fonctionnement.

Comment préparer ma phase mobile ?

Dans la plupart des cas, la seule étape nécessaire à la préparation de la phase mobile est la filtration. Le solvant doit être filtré à l’aide d’un filtre fluorocarboné de 0,45 µm (micron) (de type acétate pour une GPC en phase aqueuse).

Quels additifs sont importants et quand les utiliser ?

Dans certains cas, un additif de phase mobile est nécessaire. Par exemple, du bromure de lithium 0,05 M est ajouté à des solvants polaires tels que le DMF, le DMAC et la NMP. Ces solvants polaires sont utilisés pour analyser les polymères polaires tels que les polyuréthanes ou les polyimides. Une interaction dipolaire se produit alors, provoquant l’apparition d’épaulements artificiels du côté des masses moléculaires élevées de la distribution. Cette interaction est éliminée en ajoutant du sel. Dans le cadre d’une analyse de polyoléfines à haute température, il faut ajouter un antioxydant (la plupart des phénols encombrés suffisent), à hauteur d’environ un gramme pour 4 litres, à la phase mobile (TCB, par exemple). Cela permet de réduire l’oxydation de l’échantillon, qui reste à haute température dans le carrousel d’échantillons avant l’injection.

Comment préparer mes échantillons ? (en termes de température, durée et mélange)

La principale question à se poser avant de lancer une analyse GPC est la suivante : dans quoi mon échantillon est-il soluble ? Waters était à l’origine une entreprise opérant dans les analyses GPC et a développé une longue liste de solvants et de températures pour quasiment tous les polymères ayant déjà été traités par GPC. La durée de dissolution de l’échantillon (à température ambiante ou à température élevée) dépend généralement de deux facteurs : la masse moléculaire et la cristallinité. Plus la masse moléculaire est élevée, plus le polymère est cristallin et plus la dissolution est longue. En général, deux à trois heures, sous légère agitation, permettent la dissolution de l’échantillon. Dans certains cas (polyéthylène à masse moléculaire ultra-élevée, par exemple), plusieurs heures sont nécessaires. Le mélange à haute vitesse, la dissolution par ultrasons et la dissolution par micro-ondes doivent être évités, au risque de dégrader le polymère.

Quelle concentration et quel volume d’injection utiliser ?

En règle générale, un polymère avec un pic de masse moléculaire de 100 000 doit être préparé dans le solvant à une concentration d’environ 0,10 à 0,12 % (masse/volume). Cela représente environ 1 à 1,2 mg d’échantillon (ou d’étalon) par ml de solvant. À mesure que la masse moléculaire augmente, la concentration doit diminuer en conséquence. Ainsi, un polymère de masse moléculaire élevée (masse moyenne d’environ 3 000 000, par exemple) doit être analysé à une concentration < 0,02 % (m/v). En revanche, une résine époxy de masse moléculaire inférieure à 1 000 peut être analysée à une concentration de 0,20 %.

À ces concentrations, le volume d’injection maximal par colonne de 7,8 x 30 mm ne doit pas dépasser 100 µL.

Quels sont les avantages d’un viscosimètre et/ou d’un détecteur à diffusion de lumière intégré ?

Les chimistes chargés de la caractérisation des polymères souhaitant obtenir plus d’informations sur leurs échantillons spécifiques, de plus en plus de personnes se tournent vers des techniques de « détection avancée ». Le fait d’avoir un viscosimètre intégré avec le détecteur d’indice de réfraction vous offre trois avantages principaux par rapport à la technologie RI seule :

• Masse moléculaire « absolue » par le biais d’un étalonnage universel
• Viscosité intrinsèque du polymère sur toute la distribution
• Informations de ramification relatives à une ramification à longue chaîne

Le détecteur à diffusion de lumière vous permettra d’obtenir :

Une masse moléculaire moyenne en poids (Mw) « absolue » sans établir sur la courbe d’étalonnage le rayon de giration des informations de ramification du polymère, comme pour le viscosimètre.