Manuel d’introduction à l’UPLC

Dans la section précédente, on a établi l’avantage des particules chromatographiques plus petites et d’un étalement réduit des bandes du système [à la fois sur l’instrument et sur la colonne] a été établi. La technologie UPLC permet d’améliorer les performances chromatographiques en réduisant l’étalement des bandes du système pour obtenir des séparations plus efficaces en moins de temps, ce qui permet d’obtenir des données de meilleure qualité. L’étalement des bandes n’est cependant pas le seul facteur qui détermine les performances que l’on peut obtenir avec une faible granulométrie. La pression disponible de l’instrument joue également un rôle important.

La pression est générée intrinsèquement lorsque la phase mobile traverse la tubulure de raccordement depuis la pompe vers l’injecteur, depuis l’injecteur vers la colonne, dans la colonne elle-même, la tubulure post-colonne ainsi que la cellule du détecteur. La mesure de la pression du système est un effet cumulatif de tous ces composants [instrument et colonne]. À mesure que le débit augmente, la pression produite par la phase mobile s’écoulant dans la tubulure de raccordement elle-même augmente. De plusEn outre, le diamètre interne de la tubulure ainsi que sa longueur auront également un impact sur la pression générée en combinaison avec le débit. La différence de pression entre deux colonnes peut être comparée aux prédictions théoriques si la pression générée par l’instrument lui-même est soustraite de la pression totale du système [instrument + colonne].

Lorsque la granulométrie est réduite, la contre-pression augmente à un taux inversement proportionnel au carré du diamètre des particules. Simultanément, la vitesse optimale de la phase mobile [vélocité linéaire] augmente lorsque le diamètre des particules diminue. Par conséquent, la pression à la vélocité linéaire optimale pour une granulométrie donnée augmente à un taux inversement proportionnel au volume cubique du diamètre des particules [Figure 44].

Il s’agit d’une limitation importante lorsqu’on essaie d’utiliser des colonnes à faible granulométrie sur des instruments de HPLC classiques pour améliorer la résolution chromatographique [en maintenant une longueur de colonne constante tout en réduisant la granulométrie] ou pour améliorer la vitesse d’analyse tout en conservant la résolution [en maintenant le rapport L/d_p constant]. En raison des limites de pression des instruments de HPLC classiques

[350–400 bars ; 5 000–6 000 psi], l’utilisation d’une faible granulométrie entraîne souvent une limitation de la longueur de la colonne ou un fonctionnement à des vélocités linéaires [débits] sous-optimales.

Pour une longueur de colonne constante, la théorie prédit que si la granulométrie diminue de 5,0 µm à 1,7 µm [diminution de la granulométrie de 3x], la contre-pression devrait augmenter de 27x. S’approchant des prédictions théoriques, la pression du système a augmenté de 22x lors du passage d’une colonne de 5,0 µm à une colonne de 1,7 µm de même longueur. Comme observé, la colonne de 1,7 µm fonctionne bien au-dessus de la limite de pression supérieure d’un instrument de HPLC classique [Figure 45].

La forte augmentation de la contre-pression observée quand la granulométrie diminue est l’une des principales raisons pour lesquelles les colonnes de granulométrie inférieure à 2 µm [et les instruments LC correspondants] n’ont connu aucun succès commercial avant l’arrivée du système ACQUITY UPLC.

Si l’objectif de la séparation est de conserver la résolution tout en réduisant la durée d’analyse [en maintenant le rapport L/d_p constant], l’augmentation de la pression est bien moindre que le maintien d’une longueur de colonne constante pendant la réduction de la granulométrie. Le changement de pression est inversement proportionnel au carré de la granulométrie [plutôt qu’au cube de la granulométrie] en raison de la réduction proportionnelle de la longueur de la colonne.

Dans cet exemple, la longueur de la colonne et la granulométrie sont toutes les deux réduites de 3x [Figure 47]. Cela signifie que la contre-pression doit augmenter de 9x. Les valeurs observées correspondent étroitement aux prédictions théoriques. En maintenant L/d_p constant, une augmentation de 11x de la contre-pression est observée lors du passage d’une colonne de 5,0 µm et 150 mm de long à une colonne de 1,7 µm et 50 mm de long.

Lorsqu’une faible granulométrie est utilisée à son débit optimal, la pression produite par celle-ci dépasse les limites de pression des systèmes de HPLC classiques. Le système ACQUITY UPLC [limite de pression supérieure de 1 030 bars, 15 000 psi] a été conçu pour s’adapter à ces pressions, permettant d’analyser avec succès des particules inférieures à 2 µm à leur débit optimal.

Température élevée

Une façon de compenser les pressions plus élevées produites par une faible granulométrie consiste à élever la température de la colonne. À mesure que la température de la colonne augmente, la viscosité de la phase mobile diminue, entraînant une baisse de la contre-pression [si le débit est maintenu constant]. Cependant, la vitesse à laquelle les molécules d’analytes entrent et sortent des pores de la phase stationnaire [diffusion] augmente également, d’où la nécessité d’augmenter le débit afin de conserver les performances.

Lors de l’augmentation de la température de la colonne de 30 °C à 90 °C, le débit doit être augmenté afin de conserver l’efficacité [Figure 48]. Aucun gain d’efficacité n’est observé lors de la comparaison du nombre de plateaux le plus élevé à une quelconque température, ce qui est en accord avec la théorie chromatographique.

Une comparaison plus intéressante peut être effectuée si le nombre de plateaux est représenté graphiquement en fonction de la pression du système [Figure 49]. En traçant les données de cette manière, on peut clairement voir que l’efficacité maximale de la colonne est obtenue à peu près à la même pression du système, indépendamment de la température de séparation. Cela signifie qu’une température élevée ne peut pas être utilisée pour contourner les pressions associées à l’utilisation d’une faible granulométrie. En d’autres termes, un instrument de HPLC classique n’est pas adapté à l’utilisation efficace d’une très faible granulométrie.