Initiation à la chromatographie en phase liquide (LC)

Alumine

Forme particulaire poreuse d’oxyde d’aluminium (Al₂0₃) utilisée comme phase stationnaire en chromatographie par adsorption en phase normale. L’alumine présente une surface basique très active ; le pH d’une suspension aqueuse à 10 % est d’environ 10. Elle est successivement lavée avec un acide fort pour obtenir des suspensions neutres et acides, de pH 7,5 et 4, respectivement. L’alumine est plus hygroscopique que la silice. Son activité est mesurée selon l’échelle de Brockmann† pour la teneur en eau. Par exemple, un niveau d’activité I contient 1 % de H₂O.

†H. Brockmann et H. Schodder, Ber. 74: 73 (1941).

Ligne de base*

Partie du chromatogramme qui enregistre la réponse du détecteur lorsque seule la phase mobile sort de la colonne.

Cartouche

Type de colonne, sans raccords d’extrémité, qui consiste simplement en un tube ouvert dans lequel le matériau de remplissage est retenu par un fritté à chaque extrémité. Les cartouches SPE peuvent fonctionner en parallèle sur un système manifold sous vide. Les cartouches HPLC sont placées dans un porte-cartouche doté de raccords fluidiques intégrés à chaque extrémité. Les cartouches de protection sont faciles à remplacer, plus économiques et plus pratiques que les colonnes classiques avec raccords d’extrémité intégrés.

Chromatogramme*

Présentation graphique ou autre de la réponse d’un détecteur ou d’une autre quantité utilisée comme mesure de la concentration de l’analyte dans les effluents en fonction du volume d’effluents ou du temps. En chromatographie planaire (par exemple, la chromatographie sur couche mince ou la chromatographie sur papier), le chromatogramme peut faire référence au papier ou à la couche contenant les zones séparées.

Chromatographie*

Méthode de séparation physico-chimique dynamique dans laquelle les composants à séparer sont répartis entre deux phases, dont l’une est stationnaire (la phase stationnaire) tandis que l’autre (la phase mobile) se déplace par rapport à la phase stationnaire.

Volume de la colonne* (Vc)

Volume géométrique de la partie du tube qui contient le remplissage (surface transversale interne du tube multipliée par la longueur du lit, en L). Le volume interparticulaire de la colonne, également appelé volume interstitiel, est le volume occupé par la phase mobile entre les particules dans le lit. Le volume mort (V₀) est le volume total occupé par la phase mobile, c’est-à-dire la somme du volume interstitiel et du volume intraparticulaire (également appelé volume poreux).

Détecteur* (voir Sensibilité)

Appareil qui indique un changement de composition de l’éluant en mesurant les propriétés physiques ou chimiques (par exemple, l’absorbance de la lumière UV/visible, l’indice de réfraction différentiel, la fluorescence ou la conductivité). Si la réponse du détecteur est linéaire par rapport à la concentration de l’échantillon, il est possible de déterminer la quantité d’un composé moyennant un étalonnage adapté avec des étalons. Souvent, il peut être avantageux d’utiliser deux types de détecteurs différents en série. De cette façon, il est possible d’obtenir davantage d’informations corroborantes ou spécifiques concernant les analytes de l’échantillon. Certains détecteurs (par exemple, les détecteurs électrochimiques ou les spectromètres de masse) sont destructeurs, autrement dit, ils modifient chimiquement les composés de l’échantillon. Si un détecteur de ce type est associé à un détecteur non destructeur, il est généralement placé en second lieu dans le circuit fluidique.

Affichage

Appareil qui enregistre la réponse électrique d’un détecteur sur un écran d’ordinateur sous forme d’un chromatogramme. Les systèmes avancés d’enregistrement de données effectuent également des calculs à l’aide d’algorithmes sophistiqués, par exemple pour intégrer les surfaces de pics, soustraire les lignes de base, faire correspondre des spectres, quantifier des composés et identifier des inconnus par comparaison avec des bibliothèques standard.

Efficacité (H, voir Nombre de plateaux, Résolution, Sensibilité, Vitesse)

Mesure de la capacité d’une colonne à résister à la dispersion d’une bande d’échantillon lors de son passage à travers le lit. Une colonne efficace réduit la dispersion des bandes ou l’étalement des bandes. Une efficacité plus élevée est importante pour une séparation efficace, une plus grande sensibilité et/ou une identification des composés similaires dans un mélange d’échantillon complexe.

Martin et Synge, colauréats du prix Nobel, ont introduit, par analogie avec la distillation, le concept de hauteur de plateau (H ou H.E.P.T. pour hauteur équivalente à un plateau théorique) comme mesure de l’efficacité chromatographique et comme moyen de comparer les performances des colonnes.† Présageant des technologies HPLC et UPLC, ils ont reconnu qu’un lit homogène rempli de particules de la taille la plus petite possible (nécessitant une pression plus élevée) était la clé d’une efficacité maximale. La relation entre les paramètres de la colonne et du système chromatographique qui influent sur l’étalement des bandes a ensuite été décrite dans une équation de van Deemter.††

Les chromatographistes désignent souvent sous le terme d’efficacité une quantité qu’ils peuvent calculer facilement et directement à partir de mesures effectuées sur un chromatogramme, à savoir le nombre de plateaux (N). La hauteur de plateau est ensuite déterminée à partir du rapport de la longueur du lit de la colonne sur N (H = L/N ; les méthodes de calcul de N à partir d’un chromatogramme sont présentées dans la figure U). Il est important de noter que le calcul de N ou de H à l’aide de ces méthodes n’est correct que pour les conditions isocratiques et ne peut pas être appliqué aux séparations par gradient.

†A.J.P. Martin et R.M. Synge, Biochem. J. 35: 1358–1368 (1941)
††J.J. van Deemter, F. J. Zuiderweg et A. Klinkenberg, Chem. Eng. Sci. 5: 271–289 (1956)

Éluat

Partie de l’éluant sortant de la colonne et contenant les analytes en solution. En HPLC analytique, l’éluat est examiné par le détecteur pour déterminer la concentration ou la masse des analytes qu’il contient. En HPLC préparative, l’éluat est recueilli en continu sous forme d’aliquotes à intervalles de temps ou de volume uniformes, ou de façon discontinue uniquement lorsqu’un détecteur indique la présence d’un pic d’intérêt. Ces fractions sont ensuite traitées pour obtenir des composés purifiés.

Éluant

Phase mobile (voir Chromatographie par élution).

Série éluotropique

Liste de solvants triés par force d’élution en référence aux analytes spécifiés sur un sorbant standard. Une telle série est utile lors du développement de méthodes d’élution à la fois isocratiques et par gradient. Trappe a inventé ce terme après avoir démontré qu’une séquence de solvants de polarité croissante pouvait séparer des fractions lipidiques sur l’alumine.† Plus tard, Snyder mesura et compila les paramètres de force de nombreux solvants sur plusieurs sorbants de LC en phase normale.†† Neher créa un nomogramme très utile permettant de choisir des mélanges équi-éluotropiques (à force d’élution constante) de solvants en phase normale afin d’optimiser la sélectivité des séparations par chromatographie sur couche mince, ou TLC selon l’abréviation anglaise.†††

Une série éluotropique en phase normale typique commencerait à l’extrémité faible avec des hydrocarbures aliphatiques non polaires, tels que le pentane ou l’hexane, puis progresserait successivement vers le benzène (un hydrocarbure aromatique), le dichlorométhane (un hydrocarbure chloré), l’éther diéthylique, l’acétate d’éthyle (un ester), l’acétone (une cétone) et, enfin, le méthanol (un alcool) à l’extrémité forte (voir la figure R-1).

†W. Trappe, Biochem. Z. 305: 150 (1940)
††L. R. Snyder, Principles of Adsorption Chromatography, Marcel Dekker (1968), pp. 192–197
†††R. Neher dans G.B. Marini-Bettòlo, ed., Thin-Layer Chromatography, Elsevier (1964) pp. 75–86.

Éluer* (verbe)

Effectuer une chromatographie par élution. Le processus d’élution peut être arrêté alors que tous les composés de l’échantillon sont encore sur le lit de la colonne (chromatographie planaire sur couche mince ou sur papier), ou poursuivi jusqu’à ce que les composés aient quitté le lit de la colonne (chromatographie sur colonne).

Remarque : Le terme éluer est préférable au terme développer (utilisé en chromatographie planaire) afin d’éviter toute confusion avec la pratique du développement de méthodes, qui consiste à optimiser un système chromatographique (combinaison de phases mobile et stationnaire) pour une séparation donnée.

Chromatographie par élution*

Procédure de séparation chromatographique dans laquelle la phase mobile passe en continu à travers le lit de la colonne. En HPLC, une fois que la ligne de base du détecteur s’est stabilisée et que le système chromatographique a atteint l’équilibre, une petite quantité d’échantillon est introduite dans le flux de phase mobile. L’élution se poursuit jusqu’à ce que tous les analytes d’intérêt soient passés à travers le détecteur.

Force d’élution

Mesure de l’affinité d’un solvant par rapport à celle de l’analyte pour la phase stationnaire. Un solvant faible ne peut pas déplacer l’analyte, de sorte que ce dernier est fortement retenu sur la phase stationnaire. Un solvant fort peut déplacer toutes les molécules d’analyte et les entraîner à travers la colonne sans aucune rétention. Pour obtenir un bon équilibre entre une séparation efficace et un volume d’élution raisonnable, les solvants sont souvent mélangés pour créer une concurrence appropriée entre les phases, optimisant ainsi la sélectivité et le temps de séparation pour un ensemble donné d’analytes (voir Sélectivité).

Le moment dipolaire, la constante diélectrique, les liaisons hydrogène, la taille et la forme des molécules ainsi que la tension de surface peuvent donner une indication de la force d’élution. La force d’élution est également déterminée par le mode de séparation. Une série éluotropique de solvants peut être triée par ordre croissant de la force d’élution dans des conditions d’adsorption ou de phase normale ; cet ordre peut être pratiquement opposé dans des conditions de partage en phase inverse (voir la figure R-1).

Fluorimètre

Les détecteurs de fluorescence, ou « fluorimètres », excitent un échantillon avec une longueur d’onde de lumière donnée. Certains composés deviennent alors fluorescents et émettent de la lumière à une longueur d’onde plus élevée. Un capteur, réglé sur une longueur d’onde d’émission spécifique et masqué pour ne pas être aveuglé par la source d’excitation, recueille uniquement la lumière émise. Souvent, les analytes qui ne sont pas fluorescents à l’origine peuvent être dérivatisés pour tirer parti de la sensibilité et de la sélectivité élevées de cette forme de détection, comme c’est le cas avec la dérivatisation AccQ•Tag des acides aminés.

Débit*

Volume de phase mobile qui traverse la colonne par unité de temps. Dans les systèmes HPLC, le débit est réglé par le contrôleur du système de pompage de solvant (pompe). L’exactitude du débit peut être vérifiée par la collecte programmée et la mesure des effluents à la sortie de la colonne. Étant donné que la densité d’un solvant varie en fonction de la température, tout étalonnage ou toute mesure de débit doit prendre en compte cette variable. Les déterminations les plus exactes sont effectuées, dans la mesure du possible, en poids et non en volume.

L’uniformité (fidélité) et la reproductibilité du débit sont importantes pour de nombreuses techniques de chromatographie en phase liquide, en particulier pour les séparations dans lesquelles les temps de rétention sont essentiels à l’identification des analytes, ou en cas de chromatographie par perméation sur gel, où l’étalonnage et la corrélation des temps de rétention sont essentiels pour obtenir des mesures exactes concernant la distribution des masses moléculaires pour les polymères.

Souvent, les conditions de séparation sont comparées en fonction de la vélocité linéaire, et non du débit. La vélocité linéaire est calculée en divisant le débit par la surface transversale de la colonne. Alors que le débit est exprimé en volume/temps (par ex., mL/min), la vélocité linéaire est mesurée en longueur/temps (par ex., mm/s).

Chromatographie par perméation sur gel*

Séparation basée principalement sur des effets d’exclusion dus à des différences de taille et/ou de forme des molécules. La chromatographie par perméation sur gel et la chromatographie par filtration sur gel décrivent le procédé dans lequel la phase stationnaire est un gel gonflé. Toutes deux sont des formes de chromatographie d’exclusion stérique. Porath et Flodin ont décrit pour la première fois la filtration sur gel en utilisant des gels de dextrane et des phases mobiles aqueuses pour la séparation de biomolécules en fonction de leur taille (séparation par exclusion stérique).† Moore a appliqué des principes similaires à la séparation de polymères organiques en solution en fonction de la taille en utilisant des phases mobiles de solvant organique sur des gels de polymère poreux de polystyrène-divinylbenzène.††

†J. Porath, P. Flodin, Nature 183: 1657–1659 (1959)
††J.C. Moore, Brevet américain 3,326,875 (déposé en janvier 1963 ; délivré en juin 1967)

Gradient

Variation dans le temps des concentrations relatives de deux composés de solvants miscibles (ou plus), qui forment une phase mobile de force d’élution croissante. Un gradient discontinu est généralement utilisé dans l’extraction en phase solide ; à chaque étape, la composition de l’éluant passe brutalement d’une phase mobile plus faible à une phase mobile plus forte. Il est même possible, en séchant le lit de sorbant de SPE entre les étapes, de passer d’un solvant à un autre non miscible.

Un gradient continu est généralement généré par un système de mélange basse ou haute pression (voir les figures J-2 et J-3) selon une courbe prédéterminée (linéaire ou non) représentant la concentration du solvant B le plus fort dans le solvant A initial sur une durée déterminée. Un maintien à une composition de solvant isocratique fixe peut être programmé à tout moment dans un gradient continu. À la fin d’une séparation, le programme de gradients peut également être configuré pour revenir à la composition initiale de la phase mobile afin de rééquilibrer la colonne en vue de l’injection de l’échantillon suivant. Les systèmes HPLC sophistiqués peuvent mélanger au moins quatre solvants (ou mélanges de solvants) en un gradient continu.

Injecteur (Passeur d’échantillons, Module d’injection)

Mécanisme permettant d’introduire (injecter) avec exactitude et fidélité un volume prédéfini unique d’une solution d’échantillon dans le flux de phase mobile. L’injecteur peut être un simple dispositif manuel ou un passeur d’échantillons sophistiqué pouvant être programmé pour des injections automatiques de nombreux échantillons à partir d’une série de flacons ou de puits individuels dans une séquence prédéfinie. Les compartiments à échantillons de ces systèmes peuvent même être dotés d’un dispositif de contrôle de la température pour maintenir l’intégrité des échantillons pendant de nombreuses heures de fonctionnement.

La plupart des injecteurs modernes intègrent une sorte de boucle d’injection à remplissage par seringue qui peut être mise en ligne ou hors ligne au moyen d’une vanne multivoies. Un système d’injection bien conçu à volume interne minimal est situé aussi près que possible de l’entrée de la colonne et limite l’étalement de la bande d’échantillon. Entre les injections d’échantillon, il peut également être rincé par la phase mobile ou un solvant de lavage, avec évacuation vers les déchets, pour éviter une contamination croisée (contamination de l’échantillon actuel par un précédent).

Il est préférable de préparer les échantillons en vue de leur injection, si possible, en les dissolvant dans la phase mobile dans laquelle ils seront injectés ; cela peut éviter des problèmes de séparation et/ou de détection. Si un autre solvant doit être utilisé, il est conseillé que sa force d’élution soit égale ou inférieure à celle de la phase mobile. Il est souvent judicieux de mélanger une petite dose de la solution d’échantillon avec la phase mobile hors ligne pour détecter les éventuels problèmes de précipitation ou de miscibilité susceptibles de compromettre la séparation.

Entrée

Extrémité du lit de la colonne où entrent le flux de phase mobile et l’échantillon. Un fritté poreux et inerte retient le matériau de remplissage et protège l’entrée du lit de sorbant de la contamination particulaire. Les bonnes pratiques HPLC impliquent que les échantillons et les phases mobiles soient exempts de particules. Cela devient un impératif pour les colonnes à faible granulométrie dont les entrées peuvent se boucher beaucoup plus facilement. Si l’entrée du lit de la colonne est obstruée et présente une pression supérieure à la normale, le fait d’inverser le sens d’écoulement tout en dirigeant les effluents vers l’évacuation des déchets peut parfois déloger et chasser les dépôts d’échantillon qui se trouvent sur le fritté. Si les dépôts ont pénétré dans le fritté et se sont logés à l’extrémité de l’entrée du lit proprement dit, la colonne a très probablement atteint la fin de sa vie utile.

Chromatographie par échange d’ions* (voir la section Séparations basées sur la charge)

Ce mode de séparation est principalement basé sur les différences d’affinité d’échanges d’ions des composés de l’échantillon. La séparation d’espèces ioniques principalement inorganiques dans de l’eau ou des phases mobiles aqueuses tamponnées sur des colonnes à échange d’ions et haute efficacité, superficiellement poreuses et de faible granulométrie, suivie d’une détection conductimétrique ou électrochimique, est appelée chromatographie ionique (IC).

Élution isocratique*

Procédure dans laquelle la composition de la phase mobile reste constante pendant le processus d’élution.

Chromatographie en phase liquide* (LC)

Technique de séparation dans laquelle la phase mobile est un liquide. La chromatographie en phase liquide peut être réalisée soit sur colonne, soit sur un support plan (TLC ou chromatographie sur papier). La chromatographie en phase liquide moderne utilisant des particules plus petites et une pression d’entrée plus élevée a été appelée chromatographie liquide haute performance (ou haute pression), ou HPLC, en 1970. En 2004, la chromatographie liquide ultra-performante, ou UPLC, a considérablement amélioré les performances de la LC pour atteindre un niveau sans précédent (voir Technologie UPLC).

Phase mobile* (voir Éluat, Éluant)

Fluide qui percole, dans une direction définie, sur toute la longueur du lit de sorbant de la phase stationnaire. La phase mobile peut être un liquide (chromatographie en phase liquide), un gaz (chromatographie en phase gazeuse) ou un fluide supercritique (chromatographie en fluide supercritique). En chromatographie en phase gazeuse, la phase mobile peut être désignée par l’expression gaz vecteur. En chromatographie par élution, la phase mobile peut également être appelée éluant, tandis que le terme éluat est défini comme la partie de la phase mobile qui a traversé le lit de sorbant et contient les composés d’intérêt en solution.

Chromatographie en phase normale*

Procédure d’élution dans laquelle la phase stationnaire est plus polaire que la phase mobile. Ce terme est utilisé en chromatographie en phase liquide pour accentuer le contraste par rapport à la chromatographie en phase inverse.

Pic* (voir Nombre de plateaux)

Portion d’un chromatogramme différentiel enregistrant la réponse du détecteur alors qu’un seul composé est élué de la colonne. Si la séparation est incomplète, plusieurs composés peuvent être élués sous la forme d’un pic non résolu. Les pics élués dans des conditions optimales à partir d’une colonne efficace et bien remplie, utilisée dans un système qui limite l’étalement des bandes, s’approchent de la forme d’une distribution gaussienne. La quantification s’effectue généralement en mesurant la surface de pic (délimitée par la ligne de base et la courbe du pic). Il est plus rare qu’elle soit réalisée en fonction de la hauteur du pic (distance mesurée entre le sommet du pic et la ligne de base), car cette procédure exige que tant la largeur que la finesse du pic restent constantes.

Nombre de plateaux* (N, voir Efficacité)

Nombre indicatif des performances de la colonne (puissance de séparation mécanique ou efficacité, également appelé nombre de plateaux théoriques). Il met en relation la grandeur de rétention d’un pic avec sa largeur (variance ou étalement de la bande). Pour calculer un nombre de plateaux, on suppose qu’un pic peut être représenté par une distribution gaussienne (une courbe en cloche statistique). Aux points d’inflexion (60,7 % de la hauteur du pic), la largeur d’une courbe gaussienne est le double de l’écart-type (σ) par rapport à sa moyenne (située au sommet du pic). Comme le montre la figure U, la largeur de pic d’une courbe gaussienne mesurée à d’autres fractions de la hauteur de pic peut être exprimée en multiples précisément définis de σ. La rétention du pic (volume de rétention, V_R, ou temps de rétention, t_R) et la largeur du pic doivent être exprimées dans la même unité, car N est un nombre sans dimension. Notez que la méthode 5 sigma de calcul de N est une mesure plus stricte de l’homogénéité et des performances de la colonne, car elle est davantage influencée par l’asymétrie du pic. Les stations de données informatiques peuvent délimiter automatiquement chaque pic résolu et calculer son nombre de plateaux correspondant.

Chromatographie préparative

Procédé consistant à utiliser la chromatographie en phase liquide pour isoler un composé en quantité et à un niveau de pureté suffisants pour permettre des expériences ou utilisations ultérieures. Pour les procédés de purification pharmaceutiques ou biotechnologiques, il est possible d’utiliser des colonnes présentant un diamètre de plusieurs pieds (un pied mesurant environ 30 cm) afin de traiter plusieurs kilogrammes de matière. En revanche, pour isoler quelques microgrammes d’un produit naturel de valeur, une colonne HPLC analytique suffit. Dans les deux cas, il s’agit d’approches chromatographiques préparatives, qui ne diffèrent que par leur échelle (voir la section sur l’échelle HPLC et le tableau A).

Résolution* (Rs, voir Sélectivité)

Séparation de deux pics, exprimée comme la différence entre leurs temps de rétention correspondants, divisée par leur largeur de pic moyenne au niveau de la ligne de base. R_s = 1,25 indique que deux pics de largeur égale sont juste séparés au niveau de la ligne de base. Lorsque R_s = 0,6, la seule indication visuelle de la présence de deux pics sur un chromatogramme est une petite encoche à proximité du sommet du pic. Les colonnes à efficacité plus élevée produisent des pics plus étroits et améliorent la résolution des séparations difficiles ; cependant, la résolution n’augmente que de la racine carrée de N. La méthode la plus efficace pour augmenter la résolution consiste à améliorer la sélectivité en modifiant la combinaison phase mobile/stationnaire utilisée pour la séparation chromatographique (voir la section sur le pouvoir de séparation chimique).

Facteur de rétention* (k)

Mesure du temps durant lequel le composé de l’échantillon reste dans la phase stationnaire par rapport au temps qu’il passe dans la phase mobile ; elle indique le délai durant lequel un composé de l’échantillon est retenu par la phase stationnaire par rapport au temps qu’il lui faudrait pour traverser la colonne à la vitesse de la phase mobile. Mathématiquement, il s’agit du rapport du temps de rétention ajusté (volume) et du temps mort (volume) : k = t_R’/t_M (voir Temps de rétention et Sélectivité).

Remarque : Par le passé, cette notion a également été désignée sous les termes rapport de partage, coefficient de distribution, facteur de capacité ou coefficient de distribution massique et était symbolisée par k’.

Temps de rétention* (tR)

Temps entre le début de l’élution (généralement, en HPLC, le moment de l’injection ou de l’introduction de l’échantillon) et l’apparition du maximum du pic. Le temps de rétention ajusté, t_R’, est calculé en soustrayant de t_R le temps mort (t_M, à savoir le temps écoulé entre l’injection et l’élution du maximum du pic d’un analyte sans aucune rétention).

Chromatographie en phase inverse*

Procédure d’élution utilisée en chromatographie liquide dans laquelle la phase mobile est significativement plus polaire que la phase stationnaire, par ex. un matériau microporeux à base de silice avec des chaînes alkyle chimiquement liées à sa surface accessible. Remarque : Il convient d’éviter le terme incorrect phase inversée. (Voir la référence 4 pour de nouvelles idées sur le mécanisme des séparations en phase inverse.)

Sélectivité (Facteur de séparation, σ)

Terme utilisé pour décrire la grandeur de la différence entre les affinités thermodynamiques relatives d’une paire d’analytes pour les phases mobile et stationnaire spécifiées qui constituent le système chromatographique. Le terme correct est facteur de séparation (σ). Il est égal au rapport des facteurs de rétention, k2/k1 (voir Facteur de rétention) ; par définition, σ est toujours ≥ 1. Si σ = 1, les deux pics coéluent et aucune séparation n’a lieu. Il est important en chromatographie préparative de maximiser α pour optimiser la capacité de charge et la vitesse d’analyse. (Voir la section sur le pouvoir de séparation chimique)

Sensibilité* (S)

Signal émis par unité de concentration ou de masse d’une substance dans la phase mobile entrant dans le détecteur, par ex. la pente d’une courbe d’étalonnage linéaire (voir Détecteur). Pour les détecteurs sensibles à la concentration (par ex., les détecteurs d’absorbance UV/Vis), la sensibilité est le rapport entre la hauteur du pic et la concentration en analyte dans le pic. Pour les détecteurs sensibles au débit massique, il s’agit du rapport entre la hauteur du pic et l’unité de masse. Si la sensibilité doit être une caractéristique de performance unique, elle doit dépendre uniquement du processus de mesure chimique, et non des facteurs d’échelle.

La capacité à détecter (qualifier) ou à mesurer (quantifier) un analyte dépend de nombreux facteurs instrumentaux et chimiques. Idéalement, il convient d’obtenir des pics bien résolus (sélectivité maximale) éluant à partir de colonnes à haute efficacité (pic fin avec une bonne symétrie pour une hauteur de pic maximale) ainsi qu’une bonne sensibilité et spécificité du ou des détecteurs. Les interférences du système chromatographique et le bruit des composants électroniques doivent également être limités pour obtenir une sensibilité maximale.

Extraction en phase solide (SPE)

Technique de préparation d’échantillons qui utilise les principes de la chromatographie en phase liquide pour isoler, enrichir et/ou purifier les analytes d’une matrice complexe appliquée à un lit de colonne miniature. La SPE hors ligne est effectuée (manuellement ou par automatisation) avec des particules plus grosses dans des cartouches en plastique individuelles ou dans des puits de plaques de microélution, en utilisant une faible pression positive ou un vide pour faciliter le débit. La SPE en ligne est effectuée avec des particules plus petites dans des colonnes HPLC miniatures, en utilisant des pressions plus élevées et une vanne pour commuter la colonne SPE en ligne avec la colonne HPLC primaire, ou hors ligne vers les déchets, le cas échéant.

Les méthodes SPE emploient des gradients discontinus (voir Gradient) pour accomplir les étapes de conditionnement du lit, de chargement des échantillons, de lavage et d’élution. Les échantillons sont généralement chargés dans des conditions où la valeur k des analytes importants est aussi élevée que possible, de sorte qu’ils soient entièrement retenus pendant les étapes de chargement et de lavage. L’élution est ensuite effectuée en passant à un mélange de solvants beaucoup plus fort (voir Force d’élution). L’objectif est d’éliminer les interférences de la matrice et d’isoler l’analyte dans une solution et à une concentration adaptée à une analyse ultérieure.

Vitesse (voir Efficacité, Débit, Résolution)

Avantage des séparations LC réalisées à des vélocités linéaires plus élevées, en utilisant des colonnes analytiques à plus petit volume et à plus faible granulométrie, ou des colonnes préparatives à plus grand volume et granulométrie supérieure. La vitesse de la LC s’est considérablement améliorée à divers moments : en 1972, avec l’introduction de particules de 10 μm et de pompes capables de fournir un débit de phase mobile exact à 6 000 psi ; en 1976, avec l’apparition de colonnes préparatives à particules de 75 μm utilisées à un débit de 500 mL/min ; et en 2004, avec le lancement de la technologie UPLC, dans laquelle des colonnes à particules de 1,7 μm fonctionnent à 15 000 psi.†

Les systèmes LC analytiques haute vitesse doivent non seulement s’adapter à des pressions plus élevées dans tout le système fluidique, mais doivent également répondre à d’autres exigences : le temps de cycle de l’injecteur doit être court ; les mélangeurs à gradient doivent présenter des temps de réponse rapides entre les échantillons ; les capteurs des détecteurs doivent réagir rapidement aux variations minimes de la composition de l’éluat ; et les systèmes de données doivent collecter chaque seconde les dizaines de points nécessaires pour tracer et quantifier avec exactitude les pics fins.

Ensemble, une résolution, une vitesse et une efficacité supérieures permettent généralement d’obtenir une cadence d’analyse plus élevée. Il est alors possible d’analyser davantage d’échantillons en une journée de travail. Cela permet également de purifier de plus grandes quantités de composé par analyse ou par période de traitement.

Phase stationnaire*

Une des deux phases formant un système chromatographique. Il peut s’agir d’un solide, d’un gel ou d’un liquide. S’il s’agit d’un liquide, il peut être réparti sur un solide. Ce solide peut contribuer ou non au processus de séparation. Le liquide peut également être lié chimiquement au solide (phase greffée) ou immobilisé sur celui-ci (phase immobilisée).

L’expression lit de la colonne ou sorbant peut être utilisée comme terme général pour désigner n’importe laquelle des différentes formes sous lesquelles la phase stationnaire est utilisée.

L’utilisation du terme phase liquide pour désigner la phase mobile en LC est déconseillée. Cela évite toute confusion avec la chromatographie en phase gazeuse, dans laquelle la phase stationnaire est appelée phase liquide (constituée le plus souvent d’un liquide déposé sur un support solide).

La chromatographie de partage liquide-liquide (LLC) à colonne ouverte ne s’est pas bien transposée en HPLC. Elle a été remplacée par l’utilisation de phases greffées. La LLC s’est avérée incompatible avec les détecteurs modernes en raison de problèmes de relargage du liquide de la phase stationnaire qui se détachait de son support solide, contaminant ainsi la phase mobile liquide non miscible.

Technologie UPLC

L’utilisation d’un système LC à haute efficacité conçu pour fonctionner avec des particules inférieures à 2 µm et une pression de travail très élevée est appelée chromatographie liquide ultra-performante (technologie UPLC).† Les principaux avantages de cette technologie sont des améliorations significatives de la résolution par rapport à la HPLC et/ou des temps d’analyse plus courts, tout en conservant le niveau de résolution observé dans une séparation HPLC existante.

†Pour plus d’informations, rendez-vous sur : https://www.waters.com/uplc