Initiation à la chromatographie de convergence

Cette technique est adaptée à une grande variété d’applications en raison de la plage de sélectivité étendue de la chromatographie de convergence décrite précédemment (Tableau 5).

Quel que soit le secteur du marché ou la nature exacte des analytes testés, la CC aide à relever les défis analytiques de trois manières principales :

• La chromatographie de convergence simplifie la procédure de travail
• La chromatographie de convergence sépare les composés structurellement similaires
• La chromatographie de convergence est un mode de séparation orthogonal à la LC en phase inverse.

Nous expliquons ensuite les principaux avantages de la CC à l’aide d’exemples d’application.

Lors de l’évolution de la SFC vers la CC, la manière dont le CO₂ comprimé se mélange à une large gamme de solvants organiques pour effectuer des analyses chromatographiques impossibles auparavant a été l’une des découvertes les plus utiles. Dans cette section, nous expliquerons comment la CC peut considérablement simplifier le travail d'un laboratoire.

La simplification d’une procédure depuis le prélèvement initial de l’échantillon jusqu’à l’analyse finale est ce qui impacte généralement le plus l’activité des laboratoires. La technologie CC a la capacité de simplifier considérablement la procédure de nombreuses applications, ce qui permet de gagner du temps et de l’argent, de réduire les risques d’erreur et d’augmenter la productivité. Certaines de ces simplifications incluent :

• La combinaison de plusieurs techniques (LC et GC)
• La combinaison de plusieurs méthodes (LC en phase normale et LC en phase inverse)
• La réduction du temps de préparation des échantillons

Combiner plusieurs techniques – Analyse des lipides

L’analyse des lipides est importante pour de nombreuses raisons. Dans l’industrie pharmaceutique, les profils lipidiques sont étudiés pour déterminer l’impact de l’efficacité des médicaments chez des sujets témoins et traités.

En recherche clinique, les taux de lipides sont étudiés, car ce sont des biomarqueurs de différentes maladies et de l’efficacité des traitements. Dans les applications pour l’industrie alimentaire, certaines classes de lipides, comme les triglycérides sont profilées afin de déterminer les besoins nutritionnels ou l'authenticité des produits. Les acides gras et les triglycérides des produits pétroliers sont analysés dans les produits chimiques (par exemple, dans le biodiesel). En fonction du résultat souhaité, l’analyse des lipides nécessite différentes techniques. Pour les acides gras libres, on utilise généralement la chromatographie en phase gazeuse qui nécessite la dérivation de l’acide gras libre en ester méthylique d’acide gras (FAME) afin d’améliorer la finesse des pics et les limites de détection, notamment pour les chaînes carbonées longues. La dérivation peut prendre plusieurs heures et l’analyse GC peut durer jusqu’à 30 minutes. Les lipides plus polaires, tels que les phospholipides et les sphingolipides, nécessitent souvent une HILIC ou LC en phase normale pour séparer les différentes classes de lipides (en fonction de la nature du groupe de la tête polaire). Ensuite, les lipides plus hydrophobes d'une classe sont ciblés par la LC en phase inverse, en fonction de la longueur de la chaîne carbonée et/ou du nombre de doubles liaisons. Comme on peut le voir, un profil lipidique complet nécessite plusieurs techniques. Ce n’est pas le cas avec la CC qui sépare toutes les classes de lipides en une seule injection. La Figure 40 illustre le profil lipidique complet d’un extrait de cœur de souris avec le système ACQUITY UPC². Dans cet exemple, une colonne BEH avec un gradient générique sépare les différentes classes de lipides, produisant une séparation similaire à celle obtenue par LC en phase normale ou HILIC.

Pour les lipides neutres (c’est-à-dire le triacylglycérol (TG), le diacylglycérol (DG), les esters de cholestérol (EC) et les acides gras libres), le simple fait de modifier les paramètres de la colonne et du gradient permet de conserver et de séparer les différents lipides de chaque classe en fonction de la longueur de la chaîne de l’acide gras et du nombre de doubles liaisons (Figure 41).

Dans cette application, non seulement la CC est plus rapide que la GC (jusqu'à 10 fois plus rapide), mais aucune dérivation n'est nécessaire, ce qui simplifie considérablement la procédure globale d'analyse des lipides. L’absence de dérivation permet de gagner du temps et de minimiser les erreurs potentielles au moment de l’ajout des étapes supplémentaires dans la procédure. Sans CC, ce type de profilage et d’analyse ciblée peut nécessiter jusqu’à trois techniques différentes, ce qui entraîne une réduction du débit de l’échantillon, une utilisation plus importante de solvants, des durées analytiques plus longues et une augmentation globale du coût de l’analyse.

Combiner plusieurs méthodes de chromatographie en phase liquide – Vitamines liposolubles

L’analyse des vitamines liposolubles est essentielle pour l’industrie pharmaceutique, la recherche clinique et pour les diagnostics, ainsi que pour l’industrie alimentaire et les carburants. L'analyse des vitamines liposolubles et des caroténoïdes s'effectue généralement par LC en phase inverse ou en phase normale (Tableau 6). Parce qu’il est difficile de séparer ces composés en une seule injection, ils sont analysés individuellement à l'aide de différentes colonnes et phases mobiles, avec des temps d’analyse compris entre 10 et 30 minutes. En comparaison, la CC analyse toutes les vitamines et tous les composés apparentés en moins de 10 minutes (Figure 42). Contrairement aux méthodes d'analyse classiques répertoriées dans le Tableau 6, la méthode CC simplifiée ne nécessite que l'utilisation d'une seule colonne, d'un seul paramètre de phase mobile et d'un seul détecteur. Avec la CC, les solvants sont directement injectés ; ils sont souvent identiques à ceux utilisés pour extraire ou dissoudre les composés (par exemple, l'isooctane et l'hexane), et ne nécessitent pas de changer de solvant, ce qui est généralement requis pour l'analyse en phase inverse.

Réduction du temps de préparation des échantillons

En plus de séparer les analytes plus rapidement en combinant potentiellement plusieurs techniques et méthodes en une seule, la CC permet souvent de réduire le temps de préparation des échantillons. La compatibilité de la CC avec les solvants organiques présente les avantages suivants :

• Suppression des étapes d’hydrolyse et/ou de dérivation
• Élimination des étapes d’évaporation et de reconstitution pour changer de solvant
• Réduction du nombre d’étapes de manipulation, réduisant ainsi les erreurs expérimentales et améliorant la qualité des données 

Considérez, par exemple, les multiples étapes de préparation des échantillons et d’analyses requises pour les vitamines liposolubles dans les aliments. La Figure 43 présente une procédure type pour l’analyse des vitamines A, D et E dans les aliments. Notez que les vitamines A et E nécessitent une procédure de préparation des échantillons différente de celle de la vitamine D. Il est nécessaire de réaliser trois analyses HPLC distinctes (à la fois en phase normale et en phase inverse) pour chaque vitamine. La préparation des échantillons pour l’analyse de la vitamine D est particulièrement complexe et peut comporter de nombreuses étapes, y compris, dans certains cas, une étape HPLC semi-préparative.

La procédure de préparation des échantillons pour l’analyse des mêmes vitamines par CC est beaucoup plus simple (Figure 44) du fait de la compatibilité de la technique avec les solvants organiques non polaires utilisés au début du processus d’extraction. Dans l’exemple, en injectant directement l’échantillon issu d’une extraction à l’hexane, nous pouvons quantifier la vitamine E. L’échantillon est ensuite concentré pour l’analyse des vitamines A et D3, ce qui divise le temps d’analyse par 20 par rapport aux méthodes d’analyse classiques. De plus, la CC ne nécessite que trois étapes de préparation d’échantillons, une seule méthode et un seul instrument, alors que la procédure classique illustrée à la Figure 43 nécessite 12 étapes de préparation d’échantillons et trois méthodes sur deux instruments différents. Le Tableau 7 résume les avantages que la CC apporte aux applications décrites et en souligne d'autres qui permettent aux analystes de bénéficier d’une simplification similaire.

Séparation rapide de composés structurellement similaires

Les isomères et les analogues de structure sont parfois difficiles à séparer en raison de leur similarité structurelle, en particulier pour les isomères optiques. Nous examinerons maintenant l’utilisation de la CC pour les composés structurellement similaires suivants :

• Séparations chirales (énantiomères et diastéréoisomères)
• Isomères de position (positions différentes des groupes fonctionnels)
• Analogues de structure
  • Biomarqueurs (conjugués/non conjugués)
  • Médicaments (métabolites, impuretés, produits de dégradation)

Les différents énantiomères d’un composé peuvent souvent présenter des profils d’activité et de toxicité variables, et doivent donc être contrôlés tout au long des phases de recherche, de développement et de production. Les séparations chirales sont principalement réalisées par LC en phase normale, en utilisant des phases stationnaires à base de cellulose ou d'amylose. En LC en phase normale, les séparations par gradient sont difficiles à réaliser. Elles nécessitent des analyses isocratiques différentes sur différentes colonnes, avec des combinaisons de phases mobiles distinctes et souvent avec des solvants très toxiques. Le processus de développement de méthode peut prendre beaucoup de temps. La technologie CC, qui permet d’exécuter des gradients et de couvrir un large espace de sélectivité avec des solvants non toxiques, permet aux analystes de développer des séparations chirales en une seule journée.

Depuis de nombreuses années, les chimistes en purification reconnaissent l’intérêt de la SFC pour ce type de séparation. Bien que difficiles à obtenir correctement, les séparations analytiques SFC sont très recherchées pour un screening chiral rapide, le développement de méthodes chirales, la détermination des énantiomères en excès et les études d’inversion chirale. Contrairement à la LC en phase normale, la CC est hautement compatible avec la détection par spectrométrie de masse, car elle permet d’identifier et de caractériser les énantiomères et leur formation au cours des réactions, des procédés de fabrication et dans les systèmes biologiques (Figure 45).

La Figure 46 compare la chromatographie en phase normale et la chromatographie de convergence pour la séparation des énantiomères de la warfarine. La ligne de base en CC résout les énantiomères en une fraction de temps par rapport à la phase normale (jusqu'à 30 fois plus rapide). De plus, en éliminant les solvants toxiques, dont l’achat et l’élimination sont onéreux, le coût des séparations chirales est réduit jusqu’à 100 fois par analyse. Tous ces avantages font que la CC est la technique de prédilection pour les analyses chirales de tous types.

Isomères de position et analogues de structure

La CC s’avère utile pour séparer les isomères de position et autres analogues de structure. Les isomères de position sont des composés de même masse moléculaire (isobares), mais dont la position des groupes fonctionnels diffère. On les trouve souvent dans des applications impliquant l'analyse de matériaux de départ, le suivi de réactions et la catalyse asymétrique. Ces composés sont souvent dérivés avant l'analyse GC pour faciliter la séparation des isomères. Les méthodes de LC en phase normale sont par nature moins robustes et plus lentes. D'autre part, la sélectivité de la CC sépare facilement les isomères de position sans dérivation dans un ensemble de conditions générales.

Le système ACQUITY UPC² (Figure 47) sépare les isomères si rapidement qu'il peut aider à évaluer l'optimisation des matériaux de départ, des intermédiaires et des produits finaux de la réaction en temps réel. Les analogues de structure sont difficiles à séparer en raison de leur similarité les uns avec les autres, et ils peuvent inclure des biomarqueurs conjugués ou non conjugués (par exemple des glucuronides, des sulfates), ainsi que des métabolites, des produits de dégradation et des impuretés des composés médicamenteux. L’une des classes d’analogues de structure les plus répandues est constituée par les stéroïdes (Figure 48). La similarité structurelle entre les différents stéroïdes rend leur séparation et leur analyse difficiles, même avec une détection en spectrométrie de masse, en raison des faibles différences de masse. Il est facile de les résoudre avec la CC en utilisant un gradient de screening générique sur plusieurs colonnes en moins de deux minutes (Figure 49). Cette séparation est difficile pour la LC en phase inverse en raison de la nature non polaire des composés, et la GC nécessite une dérivation pour améliorer la finesse des pics et les limites de détection. Le couplage du système ACQUITY UPC² avec la détection en spectrométrie de masse constitue une bonne méthode d'identification et de quantification des stéroïdes.

Les analogues de structure conjugués sont plus difficiles à séparer. Les stéroïdes libres (Figure 48) sont insolubles dans l’eau. L’organisme les transforme donc en dérivés solubles dans l’eau en les convertissant sous leur forme sulfatée. Ce processus produit un groupe latéral hydrophile chargé négativement, ce qui les rend solubles dans l’eau (Figure 50). Isolés de sources naturelles à des fins thérapeutiques, ces composés servent de biomarqueurs pour étudier les maladies et déterminer l'efficacité d'un traitement. L'analyse de ces composés présente deux défis majeurs.

Tout d’abord, il faut 2,5 heures pour préparer un échantillon en vue d’une analyse GC de 30 minutes nécessitant une hydrolyse enzymatique du groupe sulfate, suivie d’une dérivation. Ensuite, la spectrométrie de masse ne peut pas distinguer certains de ces œstrogènes, car ils sont isobares (même rapport m/z). Ainsi, il est nécessaire d’utiliser la chromatographie pour séparer les différentes formes des composés isobares.

Avec la CC, 10 œstrogènes sulfatés peuvent être séparés en 15 minutes (Figure 51), y compris deux pics dont l’élution est étroite (pics 6 et 7) et qui peuvent être difficilement séparés par une analyse GC de 30 minutes (Figure 52). Avec la CC, l’échantillon n’a pas besoin d’être hydrolysé ni dérivé, car les composés sulfatés peuvent être analysés sous leur forme native. Cela réduit considérablement le nombre d'étapes nécessaires à l'analyse des formulations thérapeutiques, augmentant ainsi le rendement et la productivité.

Le Tableau 8 résume les avantages de l’utilisation de la CC pour les applications décrites ci-dessus et met en évidence d’autres domaines d’application concernés par la séparation d’énantiomères, d’isomères de position et d’analogues de structure.

Orthogonalité

Les modes de séparation orthogonaux sont complémentaires les uns des autres, mais uniques en ce sens qu’ils retiennent différemment les pics et, ce faisant, ils génèrent plus d’informations sur un échantillon qu’un seul mode de séparation. La capacité à résoudre les analytes par différentes techniques est extrêmement importante pour les raisons suivantes :

• Niveau de confiance dans l’identification et la caractérisation d’une impureté, d’un pic de dégradation ou d’un composé similaire (par exemple, les composés isobares ou les composés co-élués)
• Caractérisation complète d’un échantillon
• Possibilité d’obtenir plus d’informations sur un échantillon
• Séparation des composés souhaités provenant des interférences de la matrice

Quelques exemples de techniques de séparation orthogonale comprennent des modes complémentaires tels que la chromatographie en phase normale et en phase inverse. La sélectivité de la CC est similaire à celle de la chromatographie en phase normale, mais elle est beaucoup plus robuste, fiable (voir le Chapitre 2) et reproductible que toute méthode en phase normale. La section suivante présente des exemples d’utilisation de la CC en tant que mode de séparation orthogonal pour atteindre les objectifs ci-dessus.

Cette orthogonalité est illustrée par la séparation d’un principe pharmaceutique actif (le métoclopramide) de ses substances apparentées à l’aide des systèmes ACQUITY UPLC et ACQUITY UPC² (Figure 53). Les pics qui ne sont pas résolus par l'une des techniques le sont par l'autre et vice versa. La CC est capable de retenir les composés polaires plus longtemps que la RPLC (par exemple, les pics 1 et 2). Dans cet exemple, le système ACQUITY UPC² résout les paires critiques (pic 5 et métoclopramide), ce qui facilite la purification et l'isolement à plus grande échelle de composés inconnus en vue de leur identification et de leur caractérisation ultérieures. Tout cela fait de la CC une technique idéale à utiliser en parallèle avec d’autres techniques de routine pour résoudre divers problèmes de séparation.

Les méthodes orthogonales sont également importantes pour séparer les analytes à étudier des interférences de la matrice, par exemple en bioanalyse ou en analyse alimentaire.

La figure 54A présente un exemple typique de chromatogramme LC-MS/MS de clopidogrel extrait de plasma humain par précipitation des protéines. En raison de l'hydrophobie du clopidogrel, il élue assez tard pendant l'analyse. Les phospholipides qui interfèrent (avec un groupe de tête contenant la choline) éluent également dans cette même région (Figure 54B), entraînant potentiellement la suppression des ions du pic du clopidogrel et une quantification variable. Il est intéressant de noter que les phospholipides interférents éluent à peu près dans la même région sur le système ACQUITY UPC² (Figure 54C). En raison de l'orthogonalité de la CC par rapport à la LC en phase inverse, l'analyte à étudier élue beaucoup plus tôt et s'éloigne de ces phospholipides interférents (Figure 54D). Cela minimise le risque d’effets de matrice, garantissant une quantification plus exacte et plus fidèle.

Tous ces avantages illustrent les trois attributs clés de la CC, comme mentionnés précédemment dans ce chapitre :

1. La chromatographie de convergence simplifie la procédure de travail
2. La chromatographie de convergence sépare les composés structurellement similaires
3. La chromatographie de convergence est orthogonale à la LC en phase inverse

• Elle combine plusieurs techniques en une seule
• Elle réduit le temps de préparation et d’analyse d’échantillons
• Elle peut être utilisée pour l’injection directe de solvants/extraits organiques

• Énantiomères (chiraux)
• Isomères de position
• Analogues de structure et conjugués

• Confiance accrue dans l'identification des impuretés et des produits de dégradation
• Caractérisation complète des échantillons
• Séparation des analytes des interférences de la matrice