Behebung von Problemen mit der Peakform bei der HPLC

Ein häufiges Problem bei HPLC-Analysen ist eine Änderung der Peakform. Idealerweise sollten Peaks symmetrisch sein und eine Gauß-Form aufweisen [D. R. Stoll, LC-GC N. Am. 39 (2021), S. 353–362]. Die Symmetrie eines Peaks kann durch Berechnen des USP-Tailing-Faktors (T) quantifiziert werden, wie in Abbildung 1 dargestellt. Ein Tailing-Faktor von 1 weist auf eine perfekte Symmetrie hin, wohingegen Werte unter 1 als Fronting und Werte über 1 als Tailing bezeichnet werden. Viele Methoden geben an, dass die Tailing-Faktoren für alle Peaks kleiner sein müssen als ein festgelegter Grenzwert. Höhere Tailing-Faktoren können die Auflösung von Peaks, die nah beieinander eluieren, herabsetzen und die Integration erschweren [D. R. Stoll, LC-GC N. Am. 39 (2021), S. 353–362].

Bei der Verwendung einer etablierten Methode zur Analyse eines Probenbatch kann sich manchmal die Peakform über eine Reihe von Injektionen ändern. Dies kann dazu führen, dass die Tailing-Faktoren die Anforderung nicht erfüllen. Dieses Problem kann mehrere Ursachen haben, unter anderem Probleme mit dem HPLC-System, der mobilen Phase, der Probe und der Säule [J. W. Dolan and L. R. Snyder, Troubleshooting LC Systems, Springer Science+Business Media, New York, 1989, S. 385–420]. Bei der Fehlersuche sollten die Chromatogramme zunächst sorgfältig analysiert werden, um zu beobachten, ob die Änderung der Peakform bei allen Peaks beobachtet wird oder nur bei einigen. Im letzteren Fall sehen Sie sich die Eigenschaften der Analyten an, deren Peaks sich verändert haben, und bestimmen, wie sie sich von denen der Analyten unterscheiden, deren Peaks sich nicht verändert haben. Sind die problematischen Analyten basisch oder sauer, die anderen hingegen nicht? In diesem Fall kann die Ursache eine Änderung der Oberflächenladung der stationären Phase oder eine Änderung des pH-Wert-Werts der mobilen Phase sein. Wenn die Analyten, die die Änderung der Peakform zeigen, basisch sind, während die anderen es nicht sind, ist eine wahrscheinliche Ursache bei Reversed-Phase-Methoden der Verlust von Endcapping-Gruppen aus der stationären Phase, wodurch die Konzentration der Silanolgruppen erhöht wird. Ionisierte Silanolgruppen auf dem Basispartikel sind eine häufige Ursache für Peak-Tailing bei basischen Analyten [D. V. McCalley, Chem. Comm. 59 (2023), S. 7887–7899].

Wenn alle Peaks in einem Chromatogramm ähnliche Änderungen der Peakform aufweisen, kann ein Verschieben der Kapillare, die die Säule mit dem HPLC-System verbindet, eine mögliche Ursache sein. Dies kann bei der Verwendung von fingerfesten PEEK-Fittings passieren. Eine weitere mögliche Ursache ist ein Hohlraum in der Säule, der entstehen kann, wenn eine Säule schnellen Druckänderungen ausgesetzt ist oder unter pH-Wert- und/oder Temperaturbedingungen verwendet wird, die eine Hydrolyse der Trägerpartikel der stationäre Phase zur Folge haben. Dies geschieht häufig, wenn Säulen auf Silikabasis mit basischen (pH-Wert > 7) mobilen Phasen verwendet werden, insbesondere bei erhöhten Temperaturen (> 30 °C) [J. J. Kirkland, M. A. van Straten, H. A. Claessens, J. Chromatogr. A 691 (1995), S. 3–19., H. A. Claessens, M. A. van Straten, J. J. Kirkland, J. Chromatogr. A 728 (1996), S. 259–270]. Eine dritte mögliche Ursache ist die Ansammlung von Bestandteilen der Probenmatrix im HPLC-System und/oder in der Säule. Viele Proben enthalten Komponenten, die auf den Oberflächen des Systems und der Säule ausfallen oder stark adsorbieren können, wie z. B. Proteine, Lipide, Polysaccharide und Tenside. Wenn sich diese Komponenten auf den Oberflächen des Systems und/oder der Säule ansammeln, können sie die Flussverteilung stören und bei allen Peaks eine Veränderung der Peakform verursachen.

Betrachten Sie die in Abbildung 2 gezeigten Chromatogramme. Das anfängliche Chromatogramm zeigt fünf Peaks mit guten Tailing-Faktoren, die von 1,01 bis 1,09 reichen. Nach 200 Probeninjektionen zeigt das Chromatogramm nun, dass alle fünf Peaks erhöhte Tailing-Faktoren aufweisen, die von 1,61 bis 1,97 reichen. Der Rückdruck der Säule wies über die 200 Injektionen nur einen geringen Anstieg (3,5 %) auf.

Die Analyten sind unter den Trennbedingungen alle neutral, sodass eine Änderung der Konzentration der Silanolgruppe an der Oberfläche der stationären Phase nicht die Ursache für die Tailing-Peaks sein kann. Die mobile Phase enthielt nur Wasser und Acetonitril und die Säulentemperatur betrug 40 °C. Daher ist ein Leervolumen der Säule unwahrscheinlich. Was ist mit den Ablagerungen von Komponenten der Probenmatrix in der Säule? Die Proben enthielten Proteine sowie Fette und Zucker. Die für dieses Beispiel verwendete Säule hatte eine abnehmbare integrierte Vorsäule. Als die Vorsäule durch eine neue ersetzt wurde, wurden die Tailing-Faktoren für alle fünf Komponenten auf Werte nahe 1 wiederhergestellt, wie im unteren Chromatogramm gezeigt. Dies bestätigt, dass die Ursache für das Peak-Tailing die Ansammlung von Komponenten der Probenmatrix in der Vorsäule war. Wenn Sie mit Proben arbeiten, die Matrixkomponenten enthalten, die auf der Säule ausfallen oder stark an der Säule adsorbieren, kann die Verwendung einer Vorsäule eine relativ günstige Möglichkeit sein, um die Lebensdauer einer Säule zu maximieren. Wie in diesem Beispiel gezeigt, ist eine Vorsäule auch ein nützliches Werkzeug, um die Ursache von Problemen mit der Peakform zu ermitteln.