Leitfaden zur Größenausschlusschromatographie für Einsteiger

Um jeder Retentionszeitscheibe für das eluierte Polymer ein Molekulargewicht zuzuordnen, müssen wir unser System oder genauer den Säulensatz kalibrieren. Hierfür gibt es mehrere Möglichkeiten. Am einfachsten ist es jedoch, eine relative Kalibrierung auf Basis eines Satzes gut charakterisierter Polymerstandards mit einer möglichst engen Molekulargewichtsverteilung zu verwenden. Idealerweise würden wir eine Reihe von Standards verwenden, die monodispers sind, d. h. ein einziges Molekulargewicht haben, wobei das Verhältnis von Gewichts- und Zahlenmittel (Dispersität) gleich eins ist (Mw/Mn = 1).

Diesem Ziel kommt man am nächsten, wenn man Polymerstandards verwendet, die speziell für diesen Zweck polymerisiert werden, wie z. B. die anionisch polymerisierten schmalen Polystyrolstandards. Standards decken einen sehr breiten Molekulargewichtsbereich ab, von Monomeren bis zu Molekulargewichten > 10.000.000, mit einer Dispersität von < 1,10. Damit ein Kalibrierstandard wirklich als schmal und für die Verwendung bei der GPC-Kalibrierung akzeptabel betrachtet wird, sollte die Dispersität in der Tat < 1,10 betragen. Es gibt auch Möglichkeiten, eine breite Standardkalibrierung durchzuführen, und das universelle Kalibrierverfahren von Benoit (mit oder ohne Online-Viskosimeter) kann ebenfalls angewendet werden. Wir werden jeden dieser Punkte etwas genauer besprechen:

Relative Kalibrierung mit eng verteilten Standards

Wir bezeichnen die herkömmliche Kalibrierung mit einem schmalen Standard als relative Kalibrierung, da sich die erhaltenen Molekulargewichtsmittelungen auf das Kalibriermittel beziehen. Wenn zum Beispiel Polyethylen als Probe verwendet würde und der Säulensatz mit schmalen Polystyrol-Standards kalibriert würde, würden die nach der Integration erhaltenen Molekulargewichte auf Polystyrol basieren und für Polyethylen falsch sein. Für viele Menschen, die einfach nur die Molekulargewichte einer Unbekannten mit einer Reihe von „akzeptablen“ Werten vergleichen, ist dies jedoch in Ordnung. Ob diese Molekulargewichtswerte für das interessierende Polymer wirklich „absolut“ sind, ist unwichtig, solange die erhaltenen Werte im akzeptablen Bereich liegen.

Es gibt noch einige andere enge Standards für die organische GPC, z. B. Poly(methylmethacrylate), Polyisoprene, Polybutadiene und Poly(THF), Polystyrol ist jedoch sicherlich der wichtigste enge Standard für die organische GPC-Analyse. Bei der wässrigen GPC werden Poly(ethylenoxide) am häufigsten verwendet, zusammen mit Poly(ethylenglycolen) für ein niedriges Molekulargewicht und den Pullulanen, bei denen es sich um Polysaccharide auf Basis von Triosestrukturen handelt. Nach Messung der Serie mit schmalen Standards wird eine Polynomanpassung (normalerweise dritter oder fünfter Ordnung) durchgeführt und die resultierende Kalibrierkurve log M gegen die Retentionszeit (oder Volumen) wird aufgezeichnet.

Broad Standard Calibration (Kalibrierung mit breit verteilten Standards)

Der GPC-Säulensatz kann auch mit einem breiten Standard kalibriert werden, bei dem es sich um das gleiche Polymer handelt wie bei der unbekannten Probe. Ein breiter Standard kann von einer Vielzahl verschiedener Anbieter erworben werden, und der Standard sollte gut charakterisiert sein, d.h. die Anzahl, das Gewicht, Z und möglicherweise die Viskositätsmittelungen der Molekulargewichte wurden durch alternative Methoden bestimmt (z. B. Membranosmometrie, Lichtstreuung, Ultrazentrifugation). Eine Alternative wäre die Verwendung einer tatsächlichen „Probe“ von Material (das in signifikanter Menge vorhanden ist), bei dem die Molekulargewichtsmittelwerte durch diese anderen Techniken bestimmt worden sind. Dies hat den Vorteil, dass Tag für Tag ein Polymer verwendet werden kann, das dieselbe Struktur wie die unbekannten Proben aufweist, die analysiert werden.

Die bekannten Mittelwerte des Molekulargewichts werden in die Software eingegeben und der breite Standard wird in üblicher Weise unter denselben Bedingungen chromatographiert, unter denen auch die Unbekannten chromatographiert werden. Die Software führt eine Simplex-Suchroutine durch und passt die chromatographierte breite Standardform an die angegebenen Mittelwerte des Molekulargewichts an. Die resultierende Kalibrierkurve besteht aus den Datenpunkten für jeden Mittelwert. Wenn nur ein Zahlen- und ein Gewichtsmittel angegeben sind, besteht die resultierende Kalibrierkurve aus diesen beiden Punkten zuzüglich des Molekulargewichts des Peaks oder aus einer Drei-Punkt-Kalibrierkurve. Dieser breite Standard basiert auf Arbeiten von Hamielec aus dem Jahr 1969. Es wird empfohlen, zwei breite Standards mit unterschiedlichen Molekulargewichten zu verwenden, um den Molekulargewichtsbereich der Kalibrierkurve zu vergrößern. Selbst bei Verwendung von zwei breiten Standards mit zwei bekannten Molekulargewichtsmittelwerten erhält man nur eine Sechs-Punkte-Kalibrierkurve (unter Verwendung der Peak-Molekulargewichtswerte aus dem Ergebnis der Suchroutine). Für das QK-Labor, das jeden Tag das gleiche Polymer im gleichen Molekulargewichtsbereich wie die breiten Standards verwendet, funktioniert diese Kalibrierung jedoch sehr gut und liefert absolute Molekulargewichte.

Es gibt noch einige andere enge Standards für die organische GPC, z. B. Poly(methylmethacrylate), Polyisoprene, Polybutadiene und Poly(THF), Polystyrol ist jedoch sicherlich der wichtigste enge Standard für die organische GPC-Analyse. Bei der wässrigen GPC werden Poly(ethylenoxide) am häufigsten verwendet, zusammen mit Poly(ethylenglycolen) für ein niedriges Molekulargewicht und den Pullulanen, bei denen es sich um Polysaccharide auf Basis von Triosestrukturen handelt. Nach Messung der Serie mit schmalen Standards wird eine Polynomanpassung (normalerweise dritter oder fünfter Ordnung) durchgeführt und die resultierende Kalibrierkurve log M gegen die Retentionszeit (oder Volumen) wird aufgezeichnet.

Universelle Kalibrierung

Das Konzept der Universellen Kalibrierung wurde von Benoit, et. al. im Jahr 1967 eingeführt. Anstatt das Molekulargewicht einer Reihe enger Standards gegen die Retention aufzuzeichnen, wird das Produkt aus intrinsischer Viskosität [η] und dem Molekulargewicht M gegen die Retention aufgetragen. Das Produkt [η]M steht in Beziehung zum hydrodynamischen Volumen. Benoit hat herausgefunden, dass die Darstellung einer Reihe von hydrodynamischen Volumenwerten für verschiedene schmale Standards zu einer einzigen Kalibrierkurve führt. Mit anderen Worten passen alle Punkte zur gleichen Kurve. Sobald diese „Universal“-Kalibrierung eingerichtet wurde, kann ein beliebiges Random-Coil-Polymer in einem geeigneten Lösungsmittel gemessen und das Molekulargewicht auf Basis der Universalkurve bestimmt werden. Benoit verwendete ein Glaskapillarviskosimeter, um die Viskositäten der schmalen Standards und Proben zu messen. Nach Erstellung der Universalkurve kann für schmale Standards auch der Logarithmus der intrinsischen Viskosität gegen den Logarithmus des Molekulargewichts aufgetragen werden. Diese Darstellung wird Viskositätsgesetzdarstellung oder Mark-Houwink-Darstellung genannt. Die Steigung dieser Darstellung ist alpha (manchmal auch α genannt) und der Achsenabschnitt wird log K genannt. Die resultierende Gleichung, die als Mark-Houwink-Gleichung bekannt ist, lautet:

Das Polymer Handbook enthält viele K- und Alpha-Werte für eine Vielzahl unterschiedlicher Polymer/Lösungsmittel-Kombinationen. Man kann diese empirischen Konstanten in viele der heute erhältlichen kommerziellen GPC-Softwarepakete eingeben und so „absolute“ oder genaue Molekulargewichte für viele Polymere erhalten. Es muss sicher sein, dass die Werte im Handbuch für das zu analysierende Polymer korrekt sind, da ansonsten Fehler auftreten. 

Heutzutage können wir ein Online-Viskosimeter zusammen mit dem Differenzialbrechungsindex-Detektor (dRI) verwenden, um das Molekulargewicht jeder Schicht direkt zu bestimmen. Der dRI ist der Konzentrationsdetektor (C), und das Viskosimeter gibt uns das Produkt aus intrinsischer Viskosität und Konzentration ([η]C) an. Durch Dividieren des Viskosimetersignals durch das dRI-Signal erhalten wir die intrinsische Viskosität [n i] jedes Abschnitts des Polymerpeaks. Wir kennen jetzt die intrinsische Viskosität sowie natürlich die Retentionszeit (oder das Volumen) jeder Scheibe und können daher zur universellen Kalibrierkurve zurückkehren und das Molekulargewicht jedes Abschnitts Mi ermitteln. Dieses Konzept der Universellen Kalibrierung ist breit anwendbar, insbesondere für Random-Coil-Polymere, die die meisten heute analysierten Polymere darstellen. Andere Polymerkonformationen, wie z. B. Stäbchen, Kugeln oder kugelförmige Formen (z. B. Proteine), verhalten sich möglicherweise nicht nach den Universal-Konzepten. Damit die Universelle Kalibrierung funktioniert, darf es keine Wechselwirkung zwischen dem Polymer und dem Elutionsmittel oder dem Säulenpackungsmaterial geben.  

Ein weiterer Vorteil der Verwendung der Universellen Kalibrierung und Online-Viskositäts-/dRI-Detektion ist die Möglichkeit, die Verzweigung eines Polymers im Verhältnis zu einem bekannten linearen Polymerstandard zu bestimmen. Diese Technik reagiert recht empfindlich auf Langkettenverzweigungen (im Gegensatz zu Kurzkettenverzweigungen) und ist wichtig, um vorhersagen zu können, wie ein bestimmtes Polymer hergestellt wird oder wie die endgültigen physikalischen Eigenschaften im Vergleich zum linearen Gegenstück sein werden. 

Als Beispiel kann man ein breites lineares Polyethylen-Polymer (wie „NBS 1475“ oder ein beliebiges anderes bekanntes lineares Polyethylen) messen, wobei die resultierenden Mark-Houwink-Werte durch das Experiment bestimmt werden. Die resultierende Mark-Houwink-Auftragung (oder Viskositätsgesetz-Auftragung) ist mit einer konstanten Steigung linear (alpha ist über die Molekulargewichtsverteilung konstant). Die K- und Alpha-Werte können dann in die Software eingegeben werden und alle nachfolgenden unbekannten Polyethylene können analysiert werden, wobei die grafische Darstellung des Viskositätsgesetzes mit der des bekannten linearen Polyethylens verglichen wird.

Wenn die Unbekannte eine Langkettenverzweigung aufweist, ist die Beziehung zwischen Viskosität und Molekulargewicht nicht linear, d. h. die Viskosität steigt nicht linear mit dem Molekulargewicht. Je größer diese Abweichung von der Linearität ist, desto größer ist der Grad der Langkettenverzweigung. Ein genaues Alpha kann man für ein verzweigtes Polymer nur bei niedrigen Molekulargewichten erhalten, wo es keine Langkettenverzweigung gibt und die Steigung konstant ist. Sobald das Polymer ein Molekulargewicht erreicht hat, bei dem es eine Langkettenverzweigung gibt, ändert sich Alpha kontinuierlich (kann sogar gegen Null gehen) und wird bedeutungslos. Ein einfaches Verhältnis der Darstellung des Viskositätsgesetzes des verzweigten Polymers zum linearen Polymer ergibt den Verzweigungsindex (g'). Dabei gilt: g' = [η ]br/[η]lin. Es können weitere Berechnungen durchgeführt werden, um die Verzweigungshäufigkeit zu bestimmen, um festzustellen, welche Art von Verzweigung vorhanden ist usw. Es ist offensichtlich, dass das Hinzufügen eines Viskosimeters zusammen mit einem Brechungsindex-Detektor viel mehr Informationen über Ihr Polymer liefern kann, insbesondere:

• „Absolute“ oder genaue Molekulargewichte für Ihr Polymer per Universeller Kalibrierung
• Berechnung der intrinsischen Viskosität Ihres Polymers
• Bestimmung der Verzweigung

Durchführen einer GPC-Analyse

Das wichtigste Kriterium bei der Vorbereitung einer GPC-Analyse ist die Suche nach einem geeigneten Lösungsmittel zum Auflösen des Polymers. Das klingt trivial, aber denken Sie daran, dass es sich bei der GPC um eine Trenntechnik handelt, die auf der Größe des Polymers in der Lösung basiert. Polymerketten öffnen sich in Lösung zu einer bestimmten entspannten Konformation und das gewählte Lösungsmittel bestimmt diese Größe. Viele Polymere sind bei Raumtemperatur in verschiedenen Lösungsmitteln löslich, aber in einigen Fällen (vor allem bei hochkristallinen Polymeren) ist eine hohe Temperatur zum Lösen erforderlich. Ein weiterer wichtiger Aspekt bei der GPC-Probenvorbereitung ist die gewählte Konzentration. Wenn die Masse der Probe auf dem Säulensatz zu hoch ist, kann es zu Konzentrations- oder Viskositätseffekten kommen, die zu falschen Elutionsvolumina führen. Eine weitere Überlegung ist, ob die Polymerlösung gefiltert werden soll oder nicht. Wir werden einige dieser Überlegungen zur Probenvorbereitung besprechen.

Beachten Sie, dass in vielen Fällen, in denen Natriumnitrat gezeigt wird, viele Mitarbeiter Acetat, Sulfat, Natriumchlorid usw. verwendet haben. Wir empfehlen Natriumnitrat, das Ioneninterferenzen für neutrale und anionische Verbindungen sehr konstant minimiert. Der Grund für diese unterschiedlichen Eluenten ist die anionische Gesamtladung des Packungsmaterials. Die Gelfüllung auf Methacrylatbasis für wässrige GPC hat eine anionische Gesamtladung, die bei anionischen Proben zu Ionenausschluss und bei kationischen Proben zu Ionenadsorption führen kann, wenn sie nur in Wasser durchgeführt werden. 

Man sollte den Eluenten vor der Verwendung im Chromatographiesystem immer unter Vakuum filtrieren. Bei organischen Lösungsmitteln wird im Allgemeinen ein Fluorkohlenstofffilter verwendet. Die Porenmembrangröße des Filters beträgt im Allgemeinen 0,45 μm (Mikron). Für die wässrige GPC (Filtration des Wassers) wird ein Membranfilter vom Acetattyp verwendet. Wenn eine Lichtstreuanalyse vorbereitet wird, kann es eine gute Idee sein, den Eluenten durch einen 0,20-μm-Filter zu filtrieren Einige organische Lösungsmittel wie DMF sind sehr viskos und benetzen die Oberfläche des Fluorkohlenstofffilters nicht sehr gut. Ein guter Tipp ist es, die Filteroberfläche zunächst mit Methanol zu befeuchten und dann schnell die DMF-Filtration zu starten. Sie würden dann dieses kleine Volumen an Methanol/DMF-Gemisch verwerfen und anschließend die DMF-Filtration starten, bevor der Filter austrocknet.

Konzentration

Sobald wir das geeignete Lösungsmittel für die Analyse ausgewählt haben, besteht der nächste Schritt darin, den schmalen Standard und die Probenlösungen vorzubereiten. Wir müssen darauf achten, eine ausreichende Konzentration zu verwenden, um ein akzeptables Signal-Rausch-Verhältnis zu erhalten, ohne jedoch die Säule zu überlasten und Konzentrationswirkungen zu riskieren. Die folgende Tabelle ist eine allgemeine „Faustregel“, die als Richtlinie dafür dienen soll, welche Konzentration vorbereitet werden sollte. Diese Konzentrationen sind in Prozent angegeben, wobei 1,0 mg/mL 0,10 % entspricht. Für die Temperatur wird keine Korrektur durchgeführt, daher wird davon ausgegangen, dass alles bei Raumtemperatur vorbereitet wurde. Denken Sie daran, dass bei der Durchführung von Viskosimetrie oder Lichtstreuanalyse die exakte injizierte Masse bestimmt werden muss. Dies erfordert Dichtekorrekturen, wenn die Analyse bei erhöhter Temperatur durchgeführt wird. Die angegebenen Konzentrationen sind unter der Annahme eines maximalen Injektionsvolumens von 100 μL pro Säule zu verwenden. 

Vorbereiten der Probe

Jetzt, da wir die Standards und Proben erfolgreich im gewählten Lösungsmittel gelöst und unsere GPC-Säulen installiert haben, können wir mit der Durchführung von Injektionen beginnen. Als nächstes müssen wir entscheiden, ob wir die Probenlösung filtrieren sollen oder nicht. In fast allen Fällen sollten wir die Probenlösung vor der Injektion filtrieren.  

Im Allgemeinen würden wir, wie bei der zuvor besprochenen Lösungsmittelfiltration, einen Fluorkohlenstofffilter mit 0,45 μm auswählen. In einigen Fällen, in denen sehr feine Partikel vorhanden sind (wie z. B. Ruß, Titandioxid, Silika oder andere Füllstoffe), kann ein 0,20-μm-Filter verwendet werden.  

Wenn wir anfangen, sehr feine Filter zu verwenden, kann die Polymerscherung ein Problem darstellen. Das Filtrieren eines Polymers mit hohem Molekulargewicht durch einen 0,20-μm-Filter würde mit Sicherheit zu einem gewissen Abbau durch Scherkräfte führen. Möglicherweise muss die Probe gar nicht gefiltert werden und es besteht kein Druckanstieg aufgrund eines Verstopfens des integrierten Systemfilters oder der Säulenfritte.  

Jetzt können wir mit der Injektion der Standards und Proben beginnen. Wie bereits erwähnt, injizieren wir maximal 100 μL pro Säule bei den in der Tabelle angegebenen Konzentrationen. Unsere Laufzeit beträgt ca. 15 Minuten pro Säule bei einer Flussrate von 1,0 mL/min, sodass die Analysezeit für einen Satz mit drei Säulen ca. 45 Minuten betragen würde.  

Sobald der Probensatz gemessen wurde, muss das Datenverarbeitungssystem die Ergebnisse gemäß der von uns festgelegten Integrationsmethode verarbeiten und einen vollständigen Bericht erstellen. Dies kann automatisch im Modus Run and Report (Messen und Report erstellen) in der Empower Software erfolgen oder wir öffnen jede Rohdatendatei und integrieren jede einzelne Probe manuell.