Guide technique de la chromatographie en phase liquide préparative

Si une séparation isocratique ou un gradient ciblé ne résout pas correctement le composé d'intérêt, la séparation peut être redéveloppée en changeant le solvant, le pH, la phase stationnaire et/ou la température. Ces types de modifications peuvent avoir un impact considérable sur la séparation. Par conséquent, des gradients de référence suivis de l'optimisation de la méthode doivent être effectués après chacune de ces modifications.

Solvant

La phase mobile HPLC est constituée de trois composés ; solvant faible, solvant fort et facteur modificateur. Les solvants doivent être de pureté élevée, compatibles avec le détecteur, non réactifs avec l'échantillon et avoir une viscosité faible pour maintenir la contre-pression du système basse.

En chromatographie en phase inverse, le solvant faible est presque toujours de l'eau, tandis que l'acétonitrile et/ou le méthanol sont couramment utilisés comme solvant fort en raison de leur faible viscosité, de leur résistance élevée et de leur compatibilité avec les UV à faibles longueurs d'onde. L'acétonitrile et le méthanol fournissent également la meilleure finesse de pic, sont faciles à évaporer après isolement et ont tendance à être non réactifs avec la plupart des échantillons.

Comme pour tout solvant utilisé pour la séparation chromatographique, il est important de rester au-dessus de la valeur limite d'absorbance UV indiquée pour le solvant pendant l'analyse des échantillons. En dessous de cette valeur, les variations de la composition du solvant sont enregistrées par le détecteur sous forme de dérive de la ligne de base ou d'autres perturbations chromatographiques.

La séparation et l'ordre des pics peuvent varier en fonction du solvant fort utilisé pour la séparation. Il est difficile de prédire quel solvant fournira la résolution la plus élevée pour le composé d'intérêt. Par conséquent, le choix d'un solvant fort est souvent déterminé par des tests. Éventuellement, des solvants forts peuvent être mélangés (par exemple, un mélange acétonitrile/méthanol 50:50) pour obtenir l'ordre d'élution ou la résolution souhaités.

pH

Le pH de la phase mobile est une variable très importante dans le contrôle de la rétention pour les séparations en phase inverse. Les composés contiennent souvent un ou plusieurs groupes fonctionnels acides ou basiques. Par conséquent, la plupart des phases mobiles en phase inverse nécessitent un contrôle du pH.

Lorsqu'un acide est plus de 2 unités de pH au-dessus ou en dessous de son pK_a, il sera respectivement ionisé ou non ionisé à plus de 99 %. En revanche, les bases sont ionisées en dessous de leur pK_a et non ionisées au-dessus de leur pK_a. La forme non ionisée sera moins polaire (plus hydrophobe) et donc plus fortement retenue dans un système en phase inverse. Ainsi, les acides sont mieux retenus à pH faible, tandis que les bases sont mieux retenues à pH élevé.

Si le pH de la phase mobile est proche du pK_a du composé d'intérêt, de petites variations de pH peuvent entraîner des variations importantes de la rétention, ce qui peut avoir un impact direct sur la robustesse de la séparation. Le pH de la phase mobile est contrôlé par l'ajout d'un tampon. Le tampon maintient le pH lorsqu'une petite quantité d'acide ou de base est ajoutée. C'est lorsqu'il est utilisé à ±1 unité de pH de son pK_a qu'il est le plus efficace, mais il peut fournir une mise en tampon suffisante à ±2 unités de pH du pK_a.

Lors de la sélection d'un pH de travail, la stabilité de la colonne doit également être prise en compte.

Les colonnes à base de silice fonctionnent au mieux pour un pH situé entre 2 et 8. Une phase greffée est sensible à l'hydrolyse à pH faible et à pH élevé, le squelette de silice devient de plus en plus soluble. À des pH supérieurs à 8, une particule sans silice, ou une particule avec un ligand spécialement conçu pour une stabilité de pH élevée, est nécessaire. Les limites de pH et les recommandations générales de manipulation sont indiquées dans la notice imprimées sur l'emballage de la colonne ou sur le site Internet du fabricant de la colonne.

Lorsqu'une méthode chromatographique est destinée à être utilisée à des fins de purification, les additifs tampons utilisés pour ajuster le pH doivent être suffisamment volatils pour faciliter leur élimination de l'isolat purifié. En outre, lors de l'utilisation d'additifs volatils, veillez à éviter toute contamination ou précipitation dans la source MS. Les additifs courants tels que l'acide formique, l'acide acétique et l'acétate d'ammonium fonctionnent mieux à une concentration de 0,05 à 0,1 % lorsqu'ils sont dissous dans la phase mobile. Le phosphate, l'additif tampon le plus utilisé pour les séparations par chromatographie en phase liquide, n'est pas recommandé pour la purification ou les applications MS.

Des concentrations de tampon entre 5 et 10 mM sont recommandées. Lors de l'utilisation de tampons, il est important de filtrer le tampon après sa préparation, de rincer les lignes de la pompe lorsqu'elles ne sont pas utilisées pour éviter une précipitation en ligne et de remplacer régulièrement les solutions pour éviter l'accumulation de proliférations biologiques.

Phase stationnaire

La phase stationnaire de la colonne a une influence significative sur la séparation. Les phases stationnaires pour la plage de phases inverses vont de C₁₈ à C₈, ou peuvent contenir des ligands modifiés pour favoriser la sélectivité et le pouvoir de séparation. De nombreux laboratoires ont un stock de colonnes limité. Par conséquent, le remplacement de la phase stationnaire est souvent un dernier recours lorsque le solvant et le pH ne permettent pas une résolution adéquate. Le diagramme de sélectivité des colonnes de phase inverse de Waters (www.waters.com) offre une comparaison de la sélectivité entre différents fabricants de colonnes stationnaires. Cet outil est très utile au début du développement de méthodes pour comparer la sélectivité des colonnes.

Longueur

La longueur de la colonne influence les performances de séparation. Les colonnes sont disponibles en différentes longueurs, notamment 25 mm, 50 mm, 100 mm, 150 mm et 250 mm.

Les colonnes plus courtes ont un nombre de plaques plus faible, mais sont idéales pour les séparations rapides, tandis que les colonnes plus longues ont un nombre de plaques plus élevé, ce qui entraîne des temps de rétention plus longs. Avec une longueur plus importante, la pression, le temps d'analyse et la consommation de solvant augmentent de façon proportionnelle. Ainsi, la colonne la plus courte offrant une résolution adéquate constitue l'option idéale.

Granulométrie

La capacité de la colonne à résister à la dispersion ou à l'étalement d'une bande d'échantillon lorsqu'elle passe à travers le lit est appelée « efficacité ». Une granulométrie plus faible augmente l'efficacité, car la dispersion des pics est plus faible au sein des particules. Une efficacité élevée permet d'obtenir des largeurs de pic étroites et une meilleure capacité de séparation.

La granulométrie des colonnes préparatives varie généralement entre 5 et 10 µm, tandis que les séparations analytiques à ultra-haute pression utilisent une granulométrie allant de 1,7 à 3,5 µm. Bien que les très petites granulométries offrent une meilleure efficacité, le compromis est une augmentation du coût de la colonne et de la pression du système. Les colonnes préparatives à grande échelle, qui fonctionnent à des débits élevés avec des mélanges d'échantillons bruts, ne sont souvent pas proposées dans de très faibles granulométries pour ces raisons.

Température

Puisque des températures différentes peuvent avoir un impact sur la sélectivité, le chauffage de la colonne est un outil pratique pour optimiser la séparation d'un échantillon donné. Lorsque la température est élevée, la viscosité de la phase mobile et la pression totale du système diminuent, réduisant ainsi les contraintes exercées sur le système, les raccords et la colonne, ce qui finit par augmenter la robustesse du fonctionnement. La température peut également diminuer les temps de rétention et modifier la sélectivité de la séparation. Il est difficile de prédire si les variations de température vont augmenter ou diminuer la résolution des pics. L'utilité est donc spécifique à chaque séparation particulière.

Alors que le contrôle de la température en chromatographie à petite échelle est une habitude, la température est rarement utilisée comme paramètre de manipulation de la chromatographie dans le cadre d'une purification à l'échelle préparative. Tout d'abord, il peut être difficile de chauffer uniformément des colonnes de grand diamètre depuis l’extérieur. Ensuite, les séparations à débit élevé utilisées à grande échelle ont tendance à rester à la température du solvant entrant. Les couvertures termiques et les fours à colonne, bien que satisfaisants pour les séparations à petite échelle, ne peuvent pas chauffer une grande colonne de manière uniforme sur tout son diamètre. En conséquence, des gradients de température se forment sur tout le diamètre de la colonne, avec un effet négatif sur la chromatographie.

Si le contrôle de la température est nécessaire pour maintenir la solubilité de l'échantillon, les gradients de température peuvent être surmontés en plaçant la colonne préparative dans un bain-marie chauffé avec une longueur de tubulure raccordée à la tête de la colonne. Cette longeur de tubulure agit comme un préchauffeur pour équilibrer le solvant entrant à la température souhaitée. La chromatographie destinée à une future mise à l'échelle est mieux développée dans des conditions ambiantes, le contrôle de la température n'étant employé qu'en dernier recours.