Modifications de la forme des pics pour une colonne déjà utilisée

Comme nous l’avons vu dans cette série, les changements de forme des pics sont un problème courant dans les analyses HPLC. Dans l’idéal, les pics doivent être symétriques et décrire une courbe gaussienne [D. R. Stoll, LC-GC N. Am. 39 (2021), p. 353–362]. La symétrie d’un pic peut être mesurée en calculant le facteur de traînée USP (T), comme illustré en figure 1. Un facteur de traînée de 1 indique une symétrie parfaite. Les valeurs inférieures à 1 dénotent un front diffus et les valeurs supérieures à 1 une traînée. De nombreuses méthodes imposent que le facteur de traînée de tous les pics se situe dans une plage donnée. Les facteurs de traînée qui s’écartent sensiblement de 1 peuvent diminuer la résolution des pics à élution proche et rendre l’intégration plus difficile [D. R. Stoll, LC-GC N. Am. 39 (2021), p. 353–362].

Lorsque vous vous apprêtez à exécuter une méthode préalablement mise au point sur une colonne déjà utilisée, il convient d’effectuer un test d’aptitude afin de vérifier l’état de la colonne. Ce test doit évaluer la capacité de la colonne et du système à produire des valeurs acceptables en termes de pression, de temps de rétention, ainsi que de surface, de largeur et de symétrie des pics. Une variation significative de l’une de ces caractéristiques par rapport aux résultats précédemment obtenus avec la colonne peut indiquer un problème. La figure 2 illustre ce phénomène avec le matériau de référence de contrôle qualité en phase inverse de Waters (référence 186006363). Ce matériau de référence, qui contient sept composés, a été analysé à l’aide d’une méthode en gradient. Initialement (figure 2A), les facteurs de traînée USP étaient compris entre 0,90 et 1,27, ce qui est acceptable. Après avoir retiré la colonne du système, puis l’avoir réinstallée, la même méthode de test a été appliquée, produisant le chromatogramme illustré en figure 2B. Alors que les temps de rétention, les surfaces de pic et la pression de la colonne restaient semblables aux résultats initiaux, les facteurs de traînée USP pour les sept pics se sont révélés plus élevés, allant de 1,32 à 1,65.

Comme indiqué sdans la première partie, plusieurs causes peuvent expliquer les changements de symétrie des pics, notamment des problèmes liés au système HPLC, à la phase mobile, à l’échantillon et à la colonne [J. W. Dolan and L. R. Snyder, Troubleshooting LC Systems, Springer Scsience+Business Media, New York, 1989, p. 385–420]. Comme indiqué précédemment, un bon point de départ pour le diagnostic consiste à analyser soigneusement les chromatogrammes pour voir si tous les pics sont concernés ou seulement certains d’entre eux. Lorsque tous les pics d’un chromatogramme présentent des changements de forme similaires, comme dans la figure 2B, on peut suspecter la présence d’un vide dans la colonne, l’accumulation de composés de la matrice dans la colonne ou un mauvais raccordement de la colonne au système HPLC. Étant donné que le problème n’avait pas été observé lors de la précédente utilisation de la colonne, on peut écarter les deux premières hypothèses et supposer que le problème est dû à un mauvais raccordement de la colonne au système HPLC. Les raccordements ont été refaits et la méthode de test d’aptitude a été exécutée à nouveau. Comme le montre la figure 2C, les facteurs de traînée USP ont retrouvé leurs valeurs initiales. Cela confirme que le problème était dû à un mauvais raccordement de la colonne, créant un interstice entre la colonne et la tubulure qui la relie au système (voir figure 3). Le moindre écart suffit à provoquer une déformation des pics. Pour savoir comment connecter des colonnes avec différents types de raccords à divers systèmes HPLC, consultez la série de vidéos à cette adresse : Comment raccorder des colonnes HPLC aux systèmes LC de Waters