Praktische Ansätze zur Peptidtrennung

Während die traditionelle Peptidtrennung im Allgemeinen mithilfe von UV-Detektion durchgeführt wird, erleichtert die massengesteuerte Trennung den Aufreinigungsprozess mit einer eindeutigeren Unterscheidung zwischen dem Zielpeptid und den während der Synthese und Spaltung gebildeten Verunreinigungen. Die Massendetektion kann zur Beurteilung der Peakidentität und -homogenität in komplexen Chromatogrammen verwendet werden und erhöht den Probendurchsatz. Die Entwicklung einer Trennung, die sowohl Massen- als auch UV-Detektion umfasst, gewährleistet ein vollständigeres chromatographisches Probenprofil. Verbindungen, die nicht oder schlecht ionisieren, werden oft mit UV-Strahlung niedriger Wellenlänge detektiert. Umgekehrt lassen sich Peptide mit sehr geringer UV-Extinktion in der Regel problemlos mit MS nachweisen.

Lösungsmittel

Lösungsmittel, die üblicherweise bei der Peptidtrennung verwendet werden, darunter Acetonitril, Methanol, Ethanol und Isopropanol, sind alle mit Elektrospray (ESI) und anderen Ionisierungstechniken unter Atmosphärendruck kompatibel. Acetonitril bietet jedoch im Allgemeinen die beste Auflösung, Selektivität, Peaksymmetrie und Effizienz. Die niedrigere Viskosität von Acetonitril verringert auch den Rückdruck des LC-Systems, wenn es für chromatographische Trennungen verwendet wird. Sowohl die Flüchtigkeit als auch die Fähigkeit des Lösungsmittels, Protonen abzugeben, sind für das ESI wichtig. Flüchtige organische Lösungsmittel verringern die Oberflächenspannung der in der MS-Quelle gebildeten Tröpfchen, was eine bessere Ionisierung und höhere Empfindlichkeit fördert. Viele Peptide werden mithilfe saurer Modifikatoren wie Ameisensäure oder Trifluoressigsäure analysiert und isoliert, obwohl TFA die Ionisierung bis zu einem gewissen Grad unterdrückt. Wenn für die Methodenentwicklung eine Positiv-Negativ-Umschaltung erforderlich ist, sind mobile Phasen aus Ammoniumacetat oder Ammoniumformiat eine akzeptable, MS-freundliche Wahl. Für Peptide, die bei hohen pH-Werten besser getrennt werden, sind mit Ammoniumbicarbonat hergestellte mobile Phasen geeignet. Um die Möglichkeit von Ausfällungen im Massendetektor zu verringern, sollten flüchtige Puffer in einer Konzentration von 20 mM oder weniger verwendet werden.

Verwalten der Detektion

Die Detektion in der präparativen Chromatographie ist besonders zu beachten. Die hochkonzentrierten Peaks überschreiten den linearen Bereich der meisten Detektoren und hohe Flussraten sind mit der Detektorhardware nicht kompatibel. Einige Detektoren, wie MS und ELSD, sind destruktiv. Es ist daher notwendig, den Fluss und die Konzentration, die die Detektoren erreichen, wirksam zu reduzieren und gleichzeitig den Probenverlust zu minimieren. Ein passiver Flusssplitter wird üblicherweise verwendet, um die Probe zu teilen und zu verdünnen, bevor sie die Detektoren erreicht (Abbildungen 47 und 48). Ein Make-up-Lösungsmittel verdünnt den präparativen Probenstrom und leitet ihn zu den Detektoren.

Passive Splitter wurden für die Verwendung mit einem spezifischen chromatographischen Flussratenbereich und Splitverhältnis hergestellt. Das Flüssigkeitssystem des Splitters muss an die für die ausgewählte Säule geeignete Flussrate angepasst werden. Höhere Splitverhältnisse werden verwendet, wenn die Peaks bei höheren Konzentrationen eluieren. Häufig verwendete Flusssplitter und ihre Splitverhältnisse sind in Tabelle 6 aufgeführt.

Tabelle 6. Passive Splitter sind bei Waters erhältlich

Als Alternative zum passiven Splitten nimmt ein aktiver Splitter mechanisch Proben aus dem präparativen Strom mit einer Rate, die dem programmierten Splitverhältnis entspricht. Der Probenstrom wird dann verdünnt und mit dem Make-up-Lösungsmittel zu den Detektoren geleitet. Aktive Splitter stören jedoch häufig die Basislinie. Außerdem beeinträchtigt mechanischer Verschleiß häufig die Leistung. Sowohl passive als auch aktive Flusssplitter sind bei der Probenahme des Präparationsstroms gleich effektiv, sodass die Art des verwendeten Splitters von den Präferenzen des Anwenders abhängt.

Modifikatoren

Spezifische mobile Phasen und Modifikatoren werden basierend auf der beabsichtigten Verwendung des zu isolierenden Peptids ausgewählt. Wie bereits erwähnt, ist der Modifikator für die mobile Phase ein Additiv, das den ionischen Charakter des Peptids durch Erhöhen oder Absenken des pH-Werts steuert. Er kann auch die Hydrophobie der Probe erhöhen, indem er Ionenpaare mit den geladenen Seitenketten und Endtermini des Peptids bildet. Zu diesem Zweck wird üblicherweise Trifluoressigsäure verwendet.

Die Ionenpaarung verstärkt die Wechselwirkung des Peptids mit der hydrophoben stationären Phase der Säule, wodurch sich in der Regel die Qualität der Trennung verbessert. Leider können die mit TFA gebildeten starken Ionenpaare unter den bei der Elektrospray-Ionisierung verwendeten Bedingungen nicht ohne weiteres aufgebrochen werden. Dadurch werden weniger Peptidmoleküle ionisiert und die Signalintensität verringert sich. Idealerweise wäre der am besten geeignete Modifikator ein Modifikator, der Ionenpaare bildet, um die chromatographische Trennung zu verbessern, aber die Elektrospray-Ionisierung nicht behindert.

Apffel, et al. schlugen die Nachsäulenzugabe einer schwachen Säure, die mit der TFA um die Paarung mit dem Analyten konkurrieren würde, vor. Mit einer schwachen Säure in einer Konzentration, die hoch genug ist, um die Konkurrenz um die Protonierung der TFA zu fördern, kann die protonierte TFA verdampft werden und der Analyt kann effizienter ionisiert werden. Empfindlichkeit und Intensität des MS-Signals werden erhöht. Während zu diesem Zweck viele verschiedene Säuren in verschiedenen Konzentrationen verwendet werden können, wurde 0,1%ige Propansäure in 1:1 Wasser/organisch als Zusatzlösungsmittel bei der massengesteuerten Aufreinigung verwendet.

Monoisotopische Masse im Vergleich zur durchschnittlichen Masse

Während eine massengesteuerte Aufreinigung die Mehrdeutigkeit bei der Trennung von Peptidzielen verringert, ist es wichtig zu überlegen, welche Massen für den Fraktionstrigger verwendet werden sollten. Für die meisten Trennungen kleiner Moleküle ist die monoisotopische Masse die Hauptmasse, die zur Identifizierung verwendet wird, während andere verwandte Ionenaddukte auf Basis dieses Werts definiert und überwacht werden. Bei größeren Molekülen wie Peptiden wird manchmal die durchschnittliche Masse als primärer Identifikator verwendet.

Die monoisotopische Masse wird anhand der Masse der am häufigsten vorkommenden Isotope jedes Elements im Molekül berechnet, während die durchschnittliche Masse anhand des gewichteten Mittels aller natürlich vorkommenden Isotope jedes Elements im Molekül berechnet wird. Folglich kann bei Peptiden die durchschnittliche Masse erheblich größer sein als die monoisotopische Masse. Wenn die Anzahl der Kohlenstoffe im Molekül zunimmt, ist die Wahrscheinlichkeit größer, dass mehr 13_C vorhanden ist, was wiederum das Molekulargewicht erhöht.

Außerdem ist die monoisotopische Masse möglicherweise nicht der häufigste Peak im Massenspektrum. Es gibt zwar keine Regel, mit der festgelegt werden kann, wann eine monoisotopische Masse oder eine mittlere Masse verwendet werden soll, aber der Molekulargewichtsbereich von 1500 – 1700 ist im Allgemeinen der Übergangspunkt für den Übergang zur Verwendung der mittleren Masse zur Peptidtriggerung. In der Praxis berechnen viele verfügbare Softwareprogramme sowohl den Durchschnitt als auch das Monoisotop m/z für die Ladungszustände der Peptide. Es ist am sinnvollsten, beide Alternativen als Trigger anzugeben. Die beste Auswahl für das Triggern wird während des Screeninglaufs vor der Trennung ersichtlich.

Ladungszustände

Elektrospray, eine Technik, die Proben unter milden Bedingungen ionisiert und Moleküle mit mehreren Ladungen erzeugt, wird bei der massengesteuerten Aufreinigung häufig verwendet. Obwohl einige Peptide Molekulargewichte haben können, die über der oberen Massengrenze des Analysators liegen, fallen mehrfach geladene Ionen mit niedrigeren m/z-Werten normalerweise in den Massenbereich des Spektrometers. Mehrere Faktoren beeinflussen die Ladungszustände der Peptide, darunter der pH-Wert der Lösung, die Anzahl der sauren und basischen funktionellen Gruppen und die physikalischen Eigenschaften des bei der Analyse verwendeten Lösungsmittels.

Wie bereits erwähnt, beginnt der Trennprozess der Peptide normalerweise mit der Analyse. Das Molekulargewicht und die möglichen Ladungszustände werden berechnet, um eine einfachere Identifizierung des Peptidprodukts sicherzustellen. Während das rohe Probenprofil den Umfang der erforderlichen Methodenentwicklung zur Verbesserung der Auflösung aufzeigt, die zur Trennung eines reinen Produkts führt, liefert die Analyse auch Informationen über Ladungszustände. Betrachten Sie das Massenspektrum, das aus dem rohen analytischen Gesamtionenchromatogramm in Abbildung 49 abgeleitet ist. Die berechnete Peptidmasse beträgt 1772,9 und das positiv geladene Ion (1773,9) ist vorhanden, wenn auch in einer sehr geringen Menge. Das doppelt geladene Ion bei 887,8 ist bei weitem das am häufigsten vorkommende Ion. Eine kleine Menge des dreifach geladenen Ions (592,3) und eine Verunreinigung (781,2) sind in geringeren Mengen ebenfalls vorhanden. Trotz mehrfach geladener Ionen im Massenspektrum zeigt sich das Peptid als einzelner Peak im Chromatogramm. Doppelt und dreifach geladene Peaks eluieren vorhersehbar zur gleichen Zeit in den extrahierten Ionenchromatogrammen (Abbildung 50).

Trigger für die Fraktionssammlung

Die mehrfache Ladung von Peptiden macht es oft schwierig, die häufigste Spezies in einem bestimmten MS-Experiment vorherzusagen. Daher müssen Fraktionstrigger für die Peptidtrennung mittels massengerichteter Aufreinigung alle erwarteten mehrfach geladenen Ionen enthalten.

Datensammlung: Kontinuum vs. Zentroid

Aufgrund der Komplexität von Peptidproben, der Wahrscheinlichkeit mehrerer Ladungszustände und der Möglichkeit, mit zunehmender Peptidlänge entweder die monoisotopische oder die durchschnittliche Masse zu verwenden, sollten MS-Daten im kontinuierlichen Modus erfasst werden. Kontinuumdaten zeigen die beobachtete Intensität aller aufgelösten Punkte auf der Massenachse. Sie beinhaltet die statistische Ungenauigkeit bei der Messung des m/z-Wertes einer bestimmten Intensität. Dieses Rohsignal kann dann prozessiert werden, um die Intensität jedes der möglichen überlappenden Massensignale zu erhalten. Dies ermöglicht die Unterscheidung sehr ähnlicher m/z-Werte. Zentroid-Daten sind Kontinuumsdaten, die prozessiert werden, um einen einzelnen, zentrierten Datenpunkt für jede Ionenverteilung in einem Massenspektrum anzuzeigen, und werden als Linien im Massenspektrum angezeigt (Abbildung 51).

Beispiele für massengesteuerte Peptidtrennungen

Die folgenden zwei Peptide, die von Dr. Kelly Wasmund von Research Genetics, Inc. (Huntsville, AL, USA) zur Verfügung gestellt wurden, wurden durch massengerichtete Aufreinigung unter Verwendung der besprochenen Prinzipien isoliert:

• NH2-ISQAVHAAHAEINEAGR-COOH (abgekürzt als ISQA)
• NH2-SIINFEKL-COOH (abgekürzt als SIIN)

Jedes Peptid wurde einzeln in 0,5 mL Dimethylformamid (DMF) benetzt und dann mit Wasser auf 5,0 mL verdünnt. Die Konzentration von ISQA wurde auf 5 – 10 mg/mL und die von SIIN auf 10 mg/mL geschätzt. Die Bedingungen für Trennungen im kleinen Maßstab jedes der Peptide sind in Tabelle 7 angegeben; die chromatographischen und spektralen Ergebnisse sind in den Abbildungen 52 bzw. 53 dargestellt. Die berechneten Zielionen für die verschiedenen Ladungszustände von ISQA und SIIN sind in Tabelle 8 aufgeführt.

Lösungsmittel
A im kleinen Maßstab: 0,1 % TFA in Wasser
Lösungsmittel B: 0,1 % TFA in Acetonitril
Injektionsvol.: 40 µL
Säule: 4,6 × 50 mm Symmetry 300, C_18, 5

Lösungsmittel
A im großen Maßstab: 0,1 % TFA in Wasser Lösungsmittel B: 0,1 % TFA in Acetonitril
Injektionsvol.: 5 mL
Säule: 30 × 150 mm Symmetry 300,_18, 7 µm
Zielmassen: (ISQA) [M+H]+ = 1773,9, [M+2H]2+ = 887,5, [M+3H]3+ = 592,2, [M+4H]4+ = 447,2
Zielmassen: (SIIN) [M+H]+ = 963,5, [M+2H]2+ = 482,3, [M+3H]3+ = 321,9

Tabelle 7. Gradientenbedingungen, die bei Trennungen von ISQA und SIIN im kleinen Maßstab verwendet werden

Tabelle 8. Berechnete Zielionen für die verschiedenen Ladungszustände von ISQA und SIIN

Van-Deemter-Kurven verstehen

Fokussierte Gradienten für jedes der Peptide wurden entwickelt, um die Auflösung zwischen dem Zielpeptid und seinen eng eluierenden Verunreinigungen zu verbessern. Der präparative fokussierte Gradient für ISQA begann bei 12 % B und lief bis zu 20 % B, wobei das Peptid bei etwa 17 % B eluierte (Tabelle 9 und Abbildung 54). In ähnlicher Weise verlief der präparative fokussierte Gradient für SIIN bei 23 % – 31 % B, wobei das Produkt nahe bei 28 % B eluierte (Tabelle 10 und Abbildung 55). Die Massentrigger für die Fraktionssammlung beinhalteten die erwarteten mehrfach geladenen Ionen (Tabelle 8).

Van-Deemter-Kurven verstehen

Tabelle 9. Fokussierter Präparationsgradient für die Aufreinigung von ISQA

Tabelle 10. Fokussierter Präparationsgradient für die Aufreinigung von SIIN

Die aus den präparativen Läufen resultierenden Fraktionen wurden analysiert, um die Reinheit zu beurteilen. Zur Überwachung der Analyse wurden mehrere Detektionskanäle verwendet, um eine vollständige Charakterisierung der Fraktionen bereitzustellen. Die Fraktionsanalyse sowohl der ISQA- als auch der SIIN-Peptide wurde mit derselben Gradientenmethode durchgeführt, die für die rohe Peptidanalyse verwendet wurde. Die Ergebnisse sind für ISQA und SIIN in den Abbildungen 56 bzw. 57 dargestellt.

Zusammenfassung

Peptide füllen weiterhin eine wichtige Nische im Bereich der Therapeutika mit neuen und verbesserten Technologien für Synthese, Arzneimitteldesign, Entdeckung und Entwicklung sowie Herstellung. Trotz des technologischen Wandels bleiben die Grundlagen der Peptidtrennung mit vielen Verfahren, die auf Umkehrphasen-HPLC in Verbindung mit UV- und Massendetektion beruhen, konstant. Die Analyse des Rohpeptids mithilfe eines schnellen Gradienten, die Fokussierung des Gradienten und die geometrische Skalierung auf eine größere Säule mit Verdünnung an der Säule und Temperatursteuerung sind effektive Maßnahmen zur schnellen Trennung von Zielpeptiden. Obwohl die UV-Detektion bei der Peptidtrennung weit verbreitet ist, verringert eine massengesteuerte Aufreinigung die Anzahl der gesammelten Fraktionen und die Zeit, die für die nachfolgende Fraktionsanalyse benötigt wird. Die Steuerung des Detektorsignals mithilfe der Split- und Verdünnungstechnologie, unter Verwendung geeigneter chromatographischer mobiler Phasen, Modifikatoren und Zusatzlösungsmittel sowie die Auswahl angemessener Ladungszustände für das Triggern der Fraktionen, vereinfachen das Protokoll der Peptidaufreinigung.