Veränderungen der Peakform bei erhöhtem Injektionsvolumen

Wie in dieser Serie besprochen, sind Veränderungen der Peakform ein häufiges Problem bei HPLC-Analysen. Idealerweise sollten Peaks symmetrisch sein und eine Gauß-Form aufweisen [D. R. Stoll, LCGC N. Am. 39 (2021), S. 353–362]. Die Symmetrie eines Peaks kann durch Berechnen des USP-Tailingfaktors (T) quantifiziert werden. Dies ist in Abbildung 1 dargestellt. Ein Tailingfaktor von 1 weist auf ideale Symmetrie hin, während Werte unter 1 als „Fronting“ und Werte über 1 als „Tailing“ bezeichnet werden. Bei vielen Methoden ist es erforderlich, dass die Tailingfaktoren für alle Peaks innerhalb eines bestimmten Bereichs liegen. Tailingfaktoren, die deutlich von 1 abweichen, können die Auflösung von Peaks, die nah beieinander eluieren, verringern, was wiederum die Integration erschwert [D. R. Stoll, LCGC N. Am. 39 (2021), S. 353–362]. Außerdem ist der Peak bei schlechter Peaksymmetrie häufig breiter, als er sein sollte, wodurch die Peakhöhe abnimmt. Bei Applikationen, die die Detektion und Quantifizierung von Analyten in niedrigen Konzentrationen beinhalten, kann dies die Präzision der Ergebnisse sowie die Quantifizierungs- und Nachweisgrenzen verringern.

Ein wichtiger Schritt bei der Methodenentwicklung zur Quantifizierung von Analyten, die in niedrigen Konzentrationen vorliegen, ist die Optimierung des Injektionsvolumens. Idealerweise nehmen Peakhöhen und Peakflächen bei einer festen Probenzusammensetzung linear mit dem Injektionsvolumen zu, bis eine Massen-, Volumen- oder Detektorüberladung auftritt [U. D. Neue, HPLC Columns: Theory, Technology, and Practice, Wiley-VCH, New York, 1997, S. 355–356]. In dem in Abbildung 2A gezeigten Beispiel wurde ein Gemisch aus sechs Analyten mit einer Konzentration von jeweils 0,2 µg/mL mithilfe eines Acetonitril-Gradienten von 5 bis 95 % getrennt. Das Injektionsvolumen betrug 2 µL und es wurde eine Säule von 2,1 x 50 mm verwendet, sodass das Injektionsvolumen 1,1 % des Säulenvolumens betrug. Da die allgemeine Empfehlung lautet, dass das Injektionsvolumen 1–10 % des Säulenvolumens betragen sollte [Waters Knowledge Base 48961], schien es möglich zu sein, das Injektionsvolumen zu erhöhen, um die Signal-Rausch-Verhältnisse zu steigern. Als das Injektionsvolumen auf 4 µL erhöht wurde, wurde das in Abbildung 2B gezeigte Chromatogramm erhalten. Obwohl sich die Flächen aller sechs Peaks wie erwartet um den Faktor zwei vergrößert haben, nahm die Höhe der ersten beiden Peaks nicht zu, sondern sie wurden breiter und wiesen ein deutliches Fronting auf.

Wie in den ersten beiden Teilen bereits erwähnt, gibt es mehrere mögliche Ursachen von Veränderungen der Peaksymmetrie, einschließlich Problemen mit dem HPLC-System, der mobilen Phase, der Probe und der Säule [J. W. Dolan und L. R. Snyder, Troubleshooting LC Systems, Springer Science+Business Media, New York, 1989, S. 385–420]. Wie bereits besprochen, besteht ein guter Ausgangspunkt für die Fehlerbehebung darin, die Chromatogramme sorgfältig zu analysieren, um zu beobachten, ob die Veränderung der Peakform bei allen Peaks zu beobachten ist oder nur bei einigen. Wenn nur einige der Peaks in einem Chromatogramm Fronting-Peaks aufweisen, wie in Abbildung 2B dargestellt, können mögliche Ursachen eine Koelution einer störenden Verbindung, eine Massenüberladung und eine Verwendung eines zu starken Probenlösungsmittels sein. Da das Problem nach Erhöhen des Injektionsvolumens beobachtet wurde und die Analytkonzentrationen niedrig sind, erscheint die letztere Ursache am wahrscheinlichsten. Das Probenlösungsmittel für die in Abbildung 2A und 2B gezeigten Chromatogramme war ein Acetonitril-Wasser-Gemisch von 50/50 Vol.-%. Dieses Lösungsmittel wurde ausgewählt, da einige der Analyten in Wasser nur eine begrenzte Löslichkeit haben. Da der Gradient mit einer Acetonitrilkonzentration von nur 5 % startet, ist das Probenlösungsmittel deutlich stärker als die anfängliche mobile Phase. Die ersten Analyten, die eluieren, sind am wenigsten hydrophob und werden dadurch am meisten durch das starke Probenlösungsmittel beeinträchtigt. Um diese Hypothese zu überprüfen, wurde eine Reihe von Proben mit denselben Analytkonzentrationen, jedoch mit unterschiedlichen Acetonitril/Wasser-Verhältnissen, hergestellt. Die Tailingfaktor-Ergebnisse für die ersten zwei Peaks sind in Abbildung 3 dargestellt. Die Tailingfaktoren für beide Analyten nehmen mit steigender Acetonitrilkonzentration ab, was zeigt, dass die Verwendung eines starken Probenlösungsmittels die Ursache für die Fronting-Peaks ist, die in Abbildung 2B zu sehen sind. Um dieses Problem zu vermeiden und gleichzeitig sicherzustellen, dass die am meisten hydrophoben Analyten gelöst werden, wurde eine Acetonitrilkonzentration von 10 % gewählt. Das Chromatogramm, das sich aus der Injektion von 4 µL einer Probe ergibt, die in einem Acetonitril-Wasser-Gemisch von 10/90 Vol.-% gelöst wurde, ist in Abbildung 2C dargestellt. Jetzt weisen alle Peaks die erwartete zweifache Zunahme der Höhe im Vergleich zur 2-µL-Injektion auf – und das bei guter Peaksymmetrie. Bei der Optimierung des Injektionsvolumens sollte immer die Stärke des Probenlösungsmittels im Verhältnis zur Zusammensetzung der anfänglichen mobilen Phase berücksichtigt werden.