分析技术如何支持生物仿制药的开发

Scott Berger

阅读时间：10分钟

高分辨率分析法在创新药和生物仿制药表征方面的进展

随着制药业的重点不断从小分子药物发展到包括蛋白质疗法在内的平衡产品组合，分析化学家越来越多地面临着生产常规和自动化表征工作流程的挑战，以推动创新者和生物仿制药产品的开发和商业化。

生物治疗药物，如单克隆抗体（mAbs）是异质性的。

简介

生物治疗剂是高度复杂和异质的产品，与高度纯化的合成小分子药物有根本的不同--在尺寸、复杂性、制造方式以及证明相似性所需的数据方面。

这些复杂的生物治疗药物是多年开拓性研究和复杂制造工艺的结果，其中大量的生物治疗药物即将脱离专利保护，因此随着更多的生物药物专利到期，为创新者产品的生物仿制药的推出创造了具有挑战性但价值数十亿美元的机会。

生物治疗蛋白正在成为制药业中一个越来越重要的部分，这就要求那些在传统的小分子制药实验室中投入分析事业的科学家们将重点转移到大分子的特征和分析上。

这就要求色谱和质谱技术供应商设计专门用于支持蛋白质分析研究的仪器、软件信息学和工作流程，使创新者和生物仿制药审批所需的特征和可比性研究的采集、处理和报告更加方便和自动化。

在这个由三部分组成的系列中，我们将回顾分析型液相色谱和质谱技术如何与软件和信息学相结合，在三个层面上促进生物仿制药的开发。

什么是生物相似性？

让我们从基本知识开始。由于生物治疗药物的许多特性是独特的，并依赖于特定的制造工艺，所以只能期望生物仿制药产品表现出与参考生物治疗产品的相似性，而不是产生相同的产品变化模式。

由于生物仿制药本身的复杂性，小分子仿制药的现有监管审批途径并不适用于生物仿制药的审批。生物仿制药和其参考生物治疗产品之间的相似性需要在质量、安全和疗效方面进行评估。

事实上，监管机构认识到，对于生物药品，即使是同一制造商的批次之间，也不会生产出完全相同的产品。因此，我们说参考产品在各批次之间高度相似，预计生物仿制药生产商将在该变化范围内生产一些产品。

根据美国FDA第351条，生物仿制药是指"生物制品与参考产品高度相似，尽管在临床非活性成分上有细微差别；而且生物制品与参考产品在安全性、纯度和效力方面没有临床意义上的差异"。

这对分析化学家意味着什么？虽然创新者和生物仿制药的批次之间的差异可以通过分析检测出来，但生物仿制药开发商需要确定关键的产品属性在创新者的产品历史范围内，或者那些超出历史范围的变化对安全性、纯度或效力没有临床意义。

FDA认识到分析型液相色谱和质谱技术在定义这些关键质量属性方面的重要性。2016年底，FDA在JASMS的一篇论文 "A Retrospective Evaluation of the Use of Mass Spectrometry in FDA Biologics License Applications"中审查了LC和MS技术的影响。

在欧洲，EMA为生物仿制药发布了类似的指导方针，指出 "需要对生物仿制药和参考医药产品（原研药）同时进行广泛的最先进的特征研究，以高度保证生物仿制药的质量与参考医药产品相媲美。"

因此，评估要进行的任何特征研究的范围和相关性仍然是生物仿制药生产商的责任。

随着发达市场的监管预期变得更加明确，以及新兴市场对获得安全和有效的生物治疗药物的需求增加，生物仿制药实现市场加速增长的机会已经成熟，预测表明，到2020年全球生物仿制药市场可能达到350亿美元。

创建生物仿制药的挑战

生物仿制药的开发始于对创新者产品的全面描述，以详细说明将转化为生物仿制药产品规格的关键结构属性。

由于原研产品具有固有的批与批之间的差异，而且属性会随着时间和工艺改进周期而改变，因此必须对多个批次的质量属性进行评估（在行业会议上曾传闻有两年的批次历史），以确定创新产品的差异，从而制定生物仿制药的规格。

一旦了解了目标创新产品，就可以设计生物仿制药的生产过程，以达到创新产品的规格。这些研究的典型数据将详细说明主要结构属性（序列和修饰）、降解概况、高阶结构研究（包括聚集）和宿主细胞蛋白杂质概况。

生物仿制药的特性知识

带有UNIFI软件的生物制药平台解决方案，具有ACQUITY UPLC H-Class Bio和Xevo G2-XS QTof质谱仪。
带有UNIFI软件的生物制药平台解决方案，具有ACQUITY UPLC H-Class Bio、Xevo G2-XS QTof质谱仪，以及大分子友好型样品预处理、分析标准和色谱柱。

10多年来，沃特世一直致力于开发以生物制药为中心的分析技术和信息学，帮助分析科学家应对监管机构在创新药和生物仿制药审批中提出的特性和可比性挑战。

今天，我们的生物制药平台解决方案与UNIFI结合了生物治疗和生物仿制药分析所需的关键工作流程。

这个高分辨率的分析平台是可配置的，以支持在发现/早期开发环境中运作的生物制药实验室环境，以及在严格合规要求下运作的后期开发环境。

从根本上说，UNIFI软件可以部署在整个生物治疗机构，从药物发现到质量控制。该平台使实验室获取、共享和交流数据的方式现代化；所有数据都可以存储在中央服务器上，并由客户的个人电脑访问。

今天，UNIFI工作组可以被配置为支持最多两个UPLC/MS系统和另外四个仅有光学检测的UPLC系统。在未来，全面的企业部署将把这些能力扩展到多个实验室和不同的地理位置。

案例研究。使用UNIFI软件对英夫利西单抗进行的可比性研究

沃特世利用UNIFI的生物制药平台解决方案，对一种新的候选生物仿制药与其目标创新药单克隆抗体英夫利昔单抗（Remicade）进行了模型可比性研究。

Remicade是一种大片药物，由强生公司销售，2015年的美国销售额为45亿美元。该药是一种TNF阻断剂，目前用于治疗克罗恩病和类风湿性关节炎等自身免疫性疾病。它的欧洲专利已经过期，为生物仿制药的竞争开辟了道路，关键的美国专利也将在2018年到期。

2013年9月，Celltrion（Remsima）和Hospira（Inflectra）的头两个英夫利昔单抗生物仿制药在欧洲获得批准。总部设在美国的EPIRUS生物制药公司也报告了英夫利西单抗生物仿制药候选药物BOW015的积极的3期数据，根据严重类风湿性关节炎患者的ACR20反应来衡量，它显示了与Remicade的 "临床可比性"。EPIRUS在2014年夏天报告说，它已获得DCGI在印度境内的最终营销和生产批准。这项3期试验还显示，BOW015和Remicade在安全性或免疫原性方面没有意义上的差异。

Celltrion向美国FDA提交了其Remsima产品的英夫利西单抗生物仿制药申请，该申请于2016年春季获得批准。这是根据《平价医疗法案》在美国评估的第一个单克隆抗体（mAb）申请。辉瑞公司宣布其生物仿制药Inflectra（infliximab-dyb）于2016年秋季在美国上市。这些2016年推出的生物仿制药受到了业界的密切关注。

英夫利西单抗的生物仿制药。分析比较

在以下由Waters科学家进行的英夫利西单抗的生物仿制药可比性研究中，使用带有UNIFI的Waters生物制药平台解决方案对三个批次的创新药英夫利西单抗（在SP2/0小鼠细胞系中生产）和三个批次的候选生物仿制药英夫利西单抗（CHO细胞衍生）进行了对比。

样品在完整的蛋白质、蛋白质亚单位、蛋白质消化物、释放的聚糖部分的水平上进行分析，并分析聚集和电荷变异情况。在大多数工作流程中，六个样品中的每一个都以一式三份进行分析，以建立基线分析的可重复性。

确认主要结构（即序列）是确定与创新者产品的生物相似性的基础。

这个问题可以在完整的抗体质量分析和抗体亚单位质量分析研究的层面上间接解决，但需要高覆盖率的肽图研究来证明蛋白质链中氨基酸的线性顺序。

这些分析也有助于定义产品的属性变化，如糖基化、末端加工和其他蛋白质修饰。

 

第1部分：完整的蛋白质

完整的质量分析

任何IgG评估中合理的第一步是完整的质量测量，它可以确认理论上的分子质量和剖析更高的质量修饰（如糖基化、C端Lys变体）。这是一个简单而快速的实验，只需最少的样品准备，但它可以提供丰富的信息；它可以迅速取消生产候选生物仿制药的克隆的资格，这些克隆含有序列错误，或相对于创新药而言，其修饰变体概况有根本性的改变。

首先用快速脱盐反相UPLC/QTof MS分析法对完整的英夫利昔单抗样品进行分析，以生成创新药和生物仿制药样品之间的完整质量曲线。分析表明，创新药和生物仿制药中发现的一个共同的糖型的质量是一致的，但显示了末端赖氨酸和糖基化特征的差异。

这样的差异并不能取消候选生物仿制药的资格，但对生物仿制药组织提出了挑战，即观察结果属于生产历史的变异，或不影响分子的安全性、稳定性或有效性。

使用UNIFI软件的比较模式进行数据审查和报告，我们能够直观地比较这项研究的结果，随后应用预定义的UNIFI报告模板，自动记录我们对所有检测到的赖氨酸和糖变体的相对丰度的发现。

在完整质量水平上，可以通过使用酶去除N-聚糖结构，或去除重链C端赖氨酸残基，来降低完整质量结果的复杂性。

去除脱糖的重链表明，创新者的批次有大约40%的残留赖氨酸，而候选生物仿制药有60%或70%的赖氨酸含量。这个水平在不同批次和不同注射剂之间是一致的，除了在每个样品内部和之间建立批次间的相似性外，还为这种分析测定的可重复性设定了期望。

通过用羧肽酶B消化去除重链C端赖氨酸，可以更清晰地剖析糖变体。不幸的是，通过反相分析，羧肽酶与Lys处理过的mAb共存，所以变性SEC/UV/MS被应用于观察处理后的样品。

Waters开发了一种10分钟的变性SEC/UV/MS方法（存在有机物和酸），以实现经过羧肽酶B处理的英夫利昔单抗/生物仿制药候选物与酶和盐的基线分离。

在UNIFI软件中，所得数据的镜像图显示创新药和生物仿制药样品的主要糖型质量一致，但生物仿制药与创新药英夫利昔单抗相比，其糖变体的水平不同。值得注意的是，生物仿制药英夫利昔单抗中脱粘糖基化的糖型（G0）水平较高；而创新药样品中MAN5和G0F-GlcNAc糖型水平相对较高。

请看我们通过亚单位分析对英夫利昔单抗和一种生物仿制药进行结构比较的方法和数据。

亚单位分析。减少的LC和HC质量分析

为了简化在完整蛋白质水平上分析两组重链糖型所造成的复杂性，并更好地分析低丰度的糖型，我们将抗体还原（DTT处理）为LC和HC片段，并通过解析LC/MS方法（ACQUITY UPLC BEH C4柱，反相）进行分析，以比较创新者和生物仿制药样品的质量曲线。

解卷质谱显示，候选生物仿制药的轻链质量与创新药英夫利昔单抗具体一致；来自两个样品批次的LC的MaxEnt 1解卷谱峰显示质量在实验误差范围内一致。在轻链图谱中没有观察到糖基化或其他重要修饰的证据，而且创新药和候选生物仿制药之间的去卷积光谱中的低水平峰是一致的。

创新药和候选生物仿制药英夫利昔单抗的重链的解卷质谱再次显示，候选生物仿制药的重链质量与创新药一致，但糖类和赖氨酸变体的水平不同，这在完整的分析中第一次看到。

 

下一个。肽 水平分析

 

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