开发生物仿制药的分析工具。第三部分，糖基化、聚集和电荷变体

Scott Berger

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高分辨率分析法在创新药和生物仿制药表征方面的进展

英夫利西单抗生物仿制药。糖基化、聚合和电荷变体的分析比较

在以下由Waters科学家进行的英夫利西单抗的生物仿制药可比性研究中，使用带有UNIFI的Waters生物制药平台解决方案对三个批次的创新药英夫利西单抗（在SP2/0小鼠细胞系中生产）和三个批次的候选生物仿制药英夫利西单抗（CHO细胞衍生）进行了对比。

样品被分析为释放的聚糖部分，以及聚集和电荷变异概况。在大多数工作流程中，六个样品中的每一个都以一式三份进行分析，以建立基线分析的可重复性。

确认主要结构（即序列）是确定与创新者产品的生物相似性的基础。这个问题可以在完整的抗体质量分析和抗体亚单位质量分析研究的层面上间接解决，但需要高覆盖率的肽图研究来证明蛋白质链中氨基酸的线性顺序。这些分析也有助于定义产品的属性变化，如糖基化、末端加工和其他蛋白质修饰。

 

表征生物仿制药的分析工具

 

在这个由三部分组成的系列中，我们将回顾UPLC和QTof-MS分析技术是如何与软件和信息学相结合，在三个层面上促进生物仿制药的开发，这些技术是专门为生物制药特征设计的。

糖基化分析

在所有的抗体和许多商业化的生物治疗药物中，糖基化状态对分子的结构、稳定性、血清半衰期、免疫性和生物活性有着直接而明显的影响，并构成了一个关键的质量属性（CQA）。

描述和比较英夫利西单抗的糖基化特征，首先是通过检查完整的和减少的亚单位质量数据的糖基化特征。通过这些分析可以看出，创新药和候选生物仿制药有许多共同的糖基形式，但预计产品之间的糖基形式水平会有可测量的差异。在糖肽和释放糖层面的分析使我们能够通过更敏感和有针对性的分析来解决这些差异。

UPLC/MSE肽图显示，创新药和生物仿制药英夫利昔单抗样品都在重链胰蛋白酶肽T26上糖基化。在肽图中，我们可以跟踪在图谱研究中检测到的作为修饰肽的这种肽的单个糖型的丰度。在这种方法的一个应用中，我们显示G1F糖型的丰度在创新药和生物仿制药的三个批次中有所不同。

由UNIFI软件自动计算的G1糖型的百分比显示，生物仿制药英夫利昔单抗的水平约为18%，超出了被测试的创新药批次的范围（约25-28%）。正如正确执行的研究所预期的那样，在检查重链亚单位的完整质量数据时，观察到G1F糖型的类似丰度趋势。

糖肽趋势线图是在UNIFI软件中自动生成的，以突出所有批次和重复测试中的T26糖肽的糖变异。糖肽分析作为正交结果对完整的质量分析和释放的糖类分析（如下）是有用的，但当一个生物治疗剂包含多个不同的糖基化位点时，糖肽分析可能特别重要。

 

用于标记、释放和分析N-聚糖的Waters GlycoWorks样品制备试剂盒
GlycoWorks试剂盒用于标记、释放和分析N-聚糖。

通过酶法（PNG酶F）从创新药和候选生物仿制药的批次中释放出N-连接糖，用2-AB荧光标签（FLR）进行标记，并通过亲水作用液相色谱（HILIC）与荧光和精确质量检测相结合进行分析。样品制备和净化是通过Waters GlycoWorks试剂盒完成的，并通过Glycan Application Solution进行分析，其中包括访问Waters GU Glycan Library；这是Waters Biopharmaceutical Platform with UNIFI的一个可用选项。从FLR检测通道收集的数据被用于峰值识别和定量，准确的质量数据被用于确认首先通过保留分配的峰值。(我们的研究是在引入我们的 GlycoWorks RapiFluor-MS试剂盒 用于标记和释放N-聚糖，从而优化了该过程）。

为了产生易于重复的糖谱，使用归一化/校准的保留时间是该分析所使用的标准方法的一部分，在日常和仪器之间进行重复。

使用标记的葡聚糖梯子（聚葡萄糖）对糖类保留进行校准，该梯子与未知样品一起运行，生成葡萄糖梯子长度与保留时间的曲线。将峰值重新校准为GU或葡萄糖单位的保留值，克服了释放糖类分析中许多常见的实验变异源，并可通过搜索Waters GU糖类库中的2AB标记的糖类，进行基于GU的峰值分配。UNIFI软件自动进行GU校准，从GU数据库中进行峰值分配，对这些分配进行质量确认，并从FLR数据通道进行量化。

就英夫利西单抗而言，创新者和生物仿制药在糖基化方面有很大的差异。这并不奇怪，因为创新者的英夫利昔单抗是由SP2/0小鼠细胞系表达的，而生物仿制药英夫利昔单抗是由CHO细胞系表达的。在创新者的样品中发现了24种糖类，在生物仿制药中发现了18种。在创新药中检测到的N-聚糖种类更多，主要是由于检测到了两类含有唾液酸的聚糖（NeuAc和NeuGc），而在CHO衍生的候选生物仿制药中只观察到NeuAc形式。

在创新药中还检测到持续的低水平（约1%）的1,3-α-半乳糖（潜在的免疫原性）物种，这是唯一的。糖基化是创新药和这组候选生物仿制药样本之间最明显的主要结构差异，并可能要求生物仿制药赞助商确定观察到的差异不会对创新药公司建立的疗效、稳定性和安全性概况产生负面影响。

请看我们如何更新比较英夫利西单抗的创新药和生物仿制药的方法和数据，以使用RapiFluor-MS标签及其相应的GU糖库。

汇总分析

高阶结构是生物治疗药物的另一个关键属性，包括与增强产品免疫原性有关的、对产品安全性和有效性（效力、清除率）有负面影响的聚集物。尺寸排除色谱法（SEC）通常用于分析mAbs和其他生物治疗产品的聚集物。

创新者和候选生物仿制药的SEC色谱图重叠显示，候选生物仿制药中二聚体的含量更高。

对样品进行的批次间自动比较显示，在生物仿制药的批次中，有4-6%的蛋白质被二聚体化，这一水平比创新产品高出近10倍。生物仿制药批次之间的二聚体含量也有相当大的差异，这表明可能需要对下游工艺进行改进或对配方进行调整，以将总量减少到更典型的已上市mAb产品的水平。

电荷变体分析

蛋白质电荷变体反映了生物疗法的氨基酸修饰、糖类组成和结构变体。监测主要产品峰两侧的酸性和碱性变体峰的轮廓，通常被用来测试纯化的生物治疗剂的特性、产品质量和工艺稳定性。pH梯度和盐梯度可用于实现英夫利昔单抗电荷变体分析的最佳分离选择性。使用羧肽酶B去除重链的C端赖氨酸，可以简化电荷变异体的分析，将低丰度形式的信号提高到检测限以上，并能在分析过程中监测更多的电荷变异体。

配备UNIFI的沃特世生物制药平台解决方案支持Auto-Blend Plus技术，该技术从缓冲液、盐和水的简单浓缩储备液中自动生成流动相，简化了缓冲液的制备，降低了IEX缓冲液制备中的人为错误风险。Auto-Blend Plus梯度法确保所需的pH值和离子强度可重复地输送到IEX柱，用于电荷变体分离。通过应用盐分梯度、pH梯度或两者的组合，可以对电荷变体进行最佳的分离。Auto-Blend Plus可以在方法开发中寻找理想条件，并在优化后简化这些方法的执行。

离子交换色谱法（IEX）与紫外线检测分析完整的英夫利西单抗和LC/MS分析去糖基化的完整英夫利西单抗，用来比较创新药和生物仿制药英夫利西单抗批次中的赖氨酸变异。IEX Lys变异数据与完整的mAb和重链完整的质量结果很相关。这一点用空赖氨酸mAb变体的例子来证明。

看看Auto-Blend Plus是如何通过自动化流动相输送，提高SEC方法的pH值一致性，或用于IEX方法的开发，帮助生物制药QC实验室面向未来的。

用带有UNIFI的Waters UPLC QTof-MS生物制药平台解决方案来分析生物仿制药。
带有UNIFI软件的沃特世生物制药平台解决方案，具有ACQUITY UPLC H-Class Bio、Xevo G2-XS QTof质谱仪，以及用于分析生物仿制药的大分子友好型样品制备、分析标准和色谱柱。

生物仿制药特性研究摘要

分析技术的自动化可以最大限度地减少方法执行中的错误，并提高生产率。在这里讨论的研究中，我们展示了沃特世的分析技术和用于生物治疗的信息学工具是如何实现对创新药和候选生物仿制药英夫利昔单抗的高效表征的。该工作流程评估了主要结构（序列）、翻译后修饰（PTMs）、糖基化、二硫键模式、聚集水平和电荷变异概况的相似性，所有这些都使用了带有UNIFI的生物制药平台解决方案。

UNIFI科学信息系统的功能与Waters的UPLC、光学检测和质谱技术结合使用，使研究人员能够随时生成数据，自动处理，并在整个组织内有效沟通结果。这使生物治疗和生物仿制药开发商能够简化流程，共享方法，缩短上市时间，确保盈利和病人获得现代生物治疗药物。

 

审查。

  • 阅读我们关于生物仿制药开发的介绍 ，以及我们关于如何在完整的蛋白质水平上比较生物仿制药的分析重点
  • 阅读我们关于生物仿制药开发中的肽图（还原和非还原）的章节

 

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