5个多肽生物分析样品制备的挑战（以及如何克服它们！）。

Kim Haynes

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阅读时间：3分钟

与多肽打交道的科学家们明白，多肽的定量可能是一个挑战。成功的多肽分析的关键之一是彻底和有选择性的样品制备。

样品制备通过利用固相萃取（SPE）对不同的分析物进行化学分离并帮助去除样品中的干扰基质成分，改善了色谱和质谱分析的各个方面。

在这里，我们将讨论五个主要的多肽样品制备挑战，包括。

  • 蛋白质结合
  • 非特异性结合（NSB）
  • 肽的可溶性
  • 肽的特异性
  • 恢复

蛋白质结合
在多肽分析中，彻底的样品制备可以帮助解决蛋白质结合和非特异性结合。在你的样品制备过程中，消除肽与蛋白质（或其他基质成分）结合的一种方法是用4%的H3PO4或5%的NH4OH将血浆1：1稀释。根据你的多肽与蛋白质结合的强度，你可能需要采取更积极的步骤，如用盐酸胍、尿素或SDS变性，甚至用ACN做1:1比例的PPT。

非特异性结合
为了解决非特异性结合（NSB），在样品制备过程中的一个重要考虑因素是样品容器。肽是出了名的粘性，可能粘在玻璃上。与其使用玻璃来制备样品，不如尝试使用聚丙烯或其他材料。 采用高性能表面设计肽和蛋白质的低结合率的材料。这将有助于减少非特异性结合问题。

此外，在样品制备的干燥和重组步骤中，肽可能会因为吸附在收集容器上或未能重新溶解而丢失。这一点可以通过使用μElution格式来减少。使用µ洗脱板这样的产品可以跳过蒸发，也不需要重组，因为洗脱液的体积一般只有25-50微升。只需用水将洗脱液1:1稀释并注射。

肽的可溶性
为了防止你的肽沉淀，建议你将有机物浓度限制在不超过75%。你也可以使用改性剂来促进溶解性，但它可能需要比你在小分子中使用的浓度更高的浓度。尝试从1%到10%的酸或碱，如TFA、FA、AA或NH4OH。

肽的特异性
肽的定量需要高度敏感和可重复的方法。在许多情况下，在小分子生物分析中非常流行的蛋白质沉淀，对于敏感的多肽方法来说是不够干净的。通过建立一种样品制备方法，使用正交的净化方法，包括反相和离子交换，来选择性地捕获你的目标肽，同时允许你洗掉不需要的基质干扰，从而获得特异性。然后将你的多肽浓缩在一个小的洗脱体积中，可以用少量的水稀释并直接注入LC-MS系统中。

回收率
回收率低或不稳定通常是上述四个问题之一的症状。当你遇到低回收率时，重新审视你可以采取的步骤，以减少蛋白质结合，非特异性结合，肽的溶解度和增加肽的特异性在你的样品净化协议中。这些措施中的一个或全部可能是帮助改善你的多肽生物分析方法的关键。

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