5 洞察力。使用代用多肽法进行蛋白质定量

沃特工作人员

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阅读时间：4分钟

生物制剂的生物分析

你能让所有顶级制药公司和CRO的科学家达成共识吗？生物制药业正在增长，生物分析的蛋白质定量是困难的 - 但你有选择。下面的见解将使你了解当前的挑战、问题和解决方案。

1.生物制药业正在快速增长

生物制药药物开发正在经历快速增长。超过600种生物制品获得了美国FDA的批准，超过50种单克隆抗体（mAbs）在美国和欧盟获得批准[1]，至少还有300种mAbs正在开发中[2]。这种增长迫使科学家们解决小分子量化中不存在的各种挑战（比如这些）。

2.目前的生物分析方法有其局限性

蛋白质的定量涉及复杂的、时间密集的工作流程和艰巨的方法开发。配体结合测定（LBAs）因其高灵敏度、低成本和高通量而被传统地用于定量。尽管有这些优点，但LBAs的线性动态范围有限，有跨代谢物/模拟物交叉反应的风险，并在多路复用方面保持困难。另外，如果你感兴趣的蛋白质需要一个新的LBA抗体，开发时间和成本都很高。

3.LC-MS提供的优势

色谱和质谱（LC-MS）已经成为蛋白质生物分析的一种非常有效的方法，特别是对于药物发现、早期开发和临床前研究。与LBA相比，LC-MS有许多优势，包括提高特异性和准确性、多路复用（可以在一次运行中检测多种蛋白质）、更宽的线性动态范围、更快的方法开发（通常是几天到几周），以及不需要开发蛋白质特异性抗体。

蛋白质的LC-MS定量提供了多种选择，每一种都有优势和注意事项。以mAbs为例，工具箱里有两个主要工作流程。完整的 分析和 消化的分析。每种方法的优势取决于每个科学家的特殊要求和限制。虽然这篇博客的重点是代用肽方法，但值得一提的是，完整的mAb分析是可能的（甚至在1纳克的水平）。

对于通过LC-MS进行的完整分析，像QTof MS这样的高分辨率质谱仪（HRMS）是最理想的，因为它提供最宽的质量范围（>150 Kd）和非常高的分辨率。完整的mAbs对电离来说是个挑战，因为它们有高度带电的包膜，它们吸引盐离子，而且高度糖基化，这需要大量的样品预处理。

HRMS仪器还提供了进行定性分析的机会，并将离子流动作为一个额外的分离阶段。关于离子迁移的好处的更多信息，请参阅Nigel Ewing博士最近发表的这篇博文。

4.代用多肽方法

幻灯片2

代用肽方法由于其高灵敏度和特异性，以及在生物分析实验室中广泛使用的三重四极杆（TQ）质谱仪，已经成为最常用的基于MS的蛋白质定量策略[3]。

在这种方法中，目标蛋白被消化成较小的多肽。 然后用一个或多个具有良好选择性和敏感性的独特肽作为目标蛋白的代理（或代用）措施。然后用LC-MS分析这些代理肽。

消化对利用TQ质谱的优势至关重要，因为质荷比是2048 m/z，总质量范围约为6000 Da。一个完整的mAb具有非常大的质量，大约是150kD，对于在TQ质谱上进行完整的分析来说太大。

最后，由于其大量使用和高灵敏度，TQ质谱仪被全球监管机构视为量化的黄金标准，因此是代用肽方法的理想选择。

5.复杂的样品制备并不是一个障碍

无论是使用LBA、完整的，还是消化，蛋白质定量的工作流程，包括样品制备的要求，都是固有的耗时。代用多肽方法也不例外。多个步骤和每个步骤中的多个方面都需要优化。除了工作流程的复杂性和缺乏标准化之外，可重复的和快速的蛋白质消化仍然具有挑战性，特别是对新手来说。

为了解决这些问题，Waters的科学家们开发了ProteinWorks™ Digest Kit。这些经过验证的试剂盒有五种选择，通过将可靠的试剂、微稀释固相萃取工具、收集模块和经过验证的协议打包在一起，简化了蛋白质生物分析的工作流程，这也是分析人员成功制备样品所需要的。这些试剂盒及其协议旨在减少工作流程的步骤和变量，同时提供可重复的、灵敏的和准确的结果。

向我们的专家了解更多

业界知名的多肽和蛋白质生物分析专家之一Erin Chambers博士在最近的一次行业会议上讨论了 "通过替代肽方法进行蛋白质LC/MS生物分析的实际考虑"。在这段视频中可以听到她的见解。

在我们的应用说明中获得详细信息

参考文献。
  1. https://www.antibodysociety.org/news/approved_mabs.php
  2. https://www.bptc.com/sites/default/files/articles/ecker-2015-the_therapeutic_monoclonal_antibody_market-rprnt.pdf
  3. https://www.labome.com/method/Quantitative-Bioanalysis-of-Proteins-by-Mass-Spectrometry.html