Un cas de liaison non spécifique (NSB)

Nous sommes tous passés par là. Vous passez des heures (parfois des jours) au laboratoire à préparer vos échantillons. Vous les amenez avec précaution jusqu'au passeur automatique d'échantillons, vous chargez avec amour votre file d'attente d'échantillons et vous appuyez sur la touche play. Bien sûr, vous effectuez ces opérations pendant la nuit, car le temps de l'instrument est précieux et quelqu'un d'autre doit l'utiliser demain. Le matin, vous arrivez au laboratoire et vous vous installez immédiatement pour traiter vos données.

Et il n'y a rien là.

Tu as oublié d'injecter ? Non. Peut-être que vous n'avez pas fait de pic dans votre analyte du tout ? Tu commences à douter de ta santé mentale.

"Alors, où est passé mon échantillon ?"

Si vous êtes sûr de ne pas avoir fait les erreurs habituelles (ce que nous faisons tous), et que vous savez que votre échantillon devrait être là, mais qu'il ne l'est pas, où est-il passé ?

Les peptides et les protéines sont particulièrement susceptibles de se lier de manière non spécifique (NSB) ou d'être adsorbés sur des surfaces solides. Ces surfaces peuvent être des embouts de pipettes, des récipients de stockage d'échantillons ou des aiguilles d'injection. Nous connaissons tous les moyens d'atténuer l'adsorption, par exemple :

• utiliser des protéines porteuses (qui peuvent ajouter une complexité indésirable à nos échantillons) ou
• utiliser des fournitures de laboratoire avec des surfaces à haute performance pour empêcher l'adsorption de se produire en premier lieu.

Cependant, dans de nombreux cas, nous pouvons choisir de ne pas nous attaquer au problème.

Êtes-vous prêt à faire face aux conséquences de la liaison non spécifique dans l'analyse de vos échantillons ?
Il s'agit notamment de :

• Faible récupération
• Grande variabilité
• Sensibilité médiocre
• Gamme dynamique linéaire insuffisante

Examinons ces conséquences de plus près.

Faible récupération

Le développement de méthodes analytiques pour les peptides peut être un défi. Pendant le développement d'une méthode LC-MS, nous utilisons souvent des échantillons préparés en solution pure pour optimiser la chromatographie, identifier les fragments MS et estimer la gamme dynamique linéaire du dosage. Cependant, cela peut être problématique pour les peptides. Par exemple, le pramlintide (MW 3949.4 Da), un peptide hydrophobe de grande taille, peut être complètement perdu par le NSB lorsqu'il est en solution pure. Pour aggraver les choses, le degré de NSB observé ne dépend pas seulement du peptide, mais aussi de sa concentration. Si nous ne prenons pas de mesures pour atténuer le NSB pendant le développement de la méthode, nous pouvons arriver au travail le matin et ne voir aucun signal d'analyte. Ou bien, nous pouvons estimer de manière incorrecte les limites de détection possibles de notre test. Tout cela représente un temps supplémentaire dans notre journée qu'aucun d'entre nous ne peut se permettre de perdre.

Grande variabilité

Si nous choisissons de ne pas combattre le NSB d'une manière ou d'une autre, comment pouvons-nous être sûrs que nos échantillons répétés s'adsorbent au même rythme ? Ou dans la même quantité ? On ne peut pas.... Et cela peut conduire à une variabilité élevée. Dans cet exemple, la récupération du leuprolide (MW 1209,4 Da) en solution pure n'était que de 2 %, ce qui a entraîné une très grande variabilité avec un CV en % de 41,8 (N=3). En revanche, le leuprolide préparé avec une atténuation appropriée du NSB a donné lieu à des CV de surface de pic de 1,7 % (N=3). La variabilité élevée associée à nos échantillons de " solution pure " est inacceptable dans tout essai bioanalytique. Les données seraient rejetées et les limites inférieures de quantification du dosage seraient plus élevées que souhaité.

Faible sensibilité

Avec une faible récupération et une variabilité élevée pour notre analyte à de faibles concentrations, la gamme dynamique linéaire de notre test va être sévèrement limitée. Lorsque vous développez des tests pharmacocinétiques, vous devez être capable de quantifier votre analyte sur une large gamme, et à des niveaux potentiellement très bas. Comme les résultats de ces tests peuvent guider des décisions clés dans le développement de médicaments, il est essentiel que nous ayons confiance dans nos résultats de quantification. La prise en compte correcte du NSB peut donc faire la différence entre un essai réussi et un essai raté.

La prochaine fois que vous entrez dans le laboratoire et que vous constatez que votre analyte est manquant, posez-vous la question suivante :

"En ai-je fait assez pour combattre la liaison non spécifique ?"

Si vous n'êtes pas sûr, n'hésitez pas à demander de l'aide à nos scientifiques ici à Waters !

Surveillez notre prochain billet de blog "Échantillons perdus dans le conteneur : liaison non spécifique et impact des agents bloquants" par Moon Jung, Ph.D.

Ressources supplémentaires :

Boot Camp sur la bioanalyse des peptides et des protéines