Points forts du webinaire : Quantifier les cannabinoïdes dans le fluide oral pour déterminer l'affaiblissement des facultés de conduite après la consommation de marijuana

Personnel des eaux

Temps de lecture : 8 minutes

Q&R du webinaire sur l'utilisation d'un système de micro MS ACQUITY UPLC I-Class/Xevo TQ-S pour la quantification des cannabinoïdes dans le fluide oral

L'équipe de médecine légale de Waters a récemment parrainé un webinaire sur les avantages de l'utilisation de l'analyse quantitative des fluides oraux pour la toxicologie légale et l'affaiblissement des facultés au volant. Le webinaire a été donné par le Dr Philip Sobolesky, chercheur en chimie clinique à l'Université de Californie.

Vous trouverez ci-dessous un récapitulatif des questions posées à la fin du webinaire, dont la plupart n'ont pas reçu de réponse en direct, faute de temps.

Rediffuser le webinaire à la demande

L'efficacité d'extraction que vous avez présentée concerne-t-elle la plaque HLB ou le dispositif Quantisal ? Les calibrateurs et les contrôles sont-ils également extraits en tant qu'échantillons de patients dans le dispositif Quantisal avant la SPE ? Avez-vous effectué des évaluations de la stabilité à court ou à long terme de vos calibrateurs ?

L'efficacité d'extraction que j'ai présentée concernait la plaque HLB. J'ai fait quelques petites expériences en examinant le % de récupération des analytes à partir du dispositif de quantification et mes résultats (~30% de perte strictement due au dispositif) correspondaient à ceux des valeurs précédemment publiées (M. Fabritius, C. Staub, P. Mangin, C. Giroud, Analysis of cannabinoids in oral fluid by liquid chromatography-tandem mass spectrometry, in : Forensic Toxicol., 2013 : p. 151-163. doi:10.1007/s11419-012-0168-z.).

Jusqu'à présent, nous avons démontré qu'il n'y a pas d'effet significatif (>20% de changement) dans les Calibrateurs et les CQ's après 10 cycles de décongélation du congélateur. Les études de stabilité à long terme sont toujours en cours avec une stabilité validée d'un an pour les Calibrateurs et les CQ's.

Différentes souches de marijuana contiennent différents profils de cannabinoïdes. Comment ce test évitera-t-il d'être biaisé par des concentrations élevées de CBN, par exemple (une molécule qui résulte de la dégradation des cannabinoïdes par la chaleur et la lumière) ? Si le CBN était utilisé comme indicateur, on pourrait dire que ce n'est pas un moyen précis de déterminer l'affaiblissement des facultés en fonction du temps.

On pourrait arguer que le CBN n'est pas un bon indicateur en raison de sa forte dégradation, mais nous n'avons pas encore vu de patient dont le niveau de CBN était supérieur à la concentration correspondante de THC. Par conséquent, lorsque nos données seront finalisées, il est fort probable qu'une concentration de THC (>x) sera associée à une déficience, ce qui pourra être confirmé par la présence d'une concentration de CBN (y).

De plus, les résultats ont-ils été modifiés lors de l'introduction de la prise de nourriture ? (Vous avez mentionné qu'il y avait une pause déjeuner.) Un taux de glucose élevé dans le sang pose-t-il des problèmes d'exactitude et de précision ?

Jusqu'à présent, nous n'avons pas détecté de résultats anormaux après le déjeuner qui pourraient indiquer une interférence alimentaire, mais nous ne mesurons pas non plus la glycémie à un moment donné. Il est donc difficile de répondre à votre question puisqu'aucune étude n'a été menée sur les interférences du glucose sur les concentrations de cannabinoïdes.

J'avais vu des données d'applications précédentes de Waters où de l'acétonitrile (1 ml je crois) était ajouté au tampon de quantification. Cela semble faciliter les récupérations. Un commentaire à ce sujet, et comment êtes-vous arrivé à 1 ml d'acide phosphorique à 4% ?

Je suis arrivé à ajouter 0,4 ml de H3PO4 à 4 % à 1 ml d'OF/tampon en raison d'études validées précédentes utilisant cette quantité. De plus, l'ajout des analytes dans l'acide phosphorique est une pratique standard avec Oasis Prime SPE, je n'ai donc pas effectué d'optimisation à cette étape. (M. Fabritius, C. Staub, P. Mangin, C. Giroud, Analysis of cannabinoids in oral fluid by liquid chromatography-tandem mass spectrometry, in : Toxicologie médico-légale, 2013 : p. 151-163. doi:10.1007/s11419-012-0168-z.).

On rapporte que les concentrations de THC-COOH dans le fluide oral sont de l'ordre du picogramme/ml. Cela semble être indépendant du tampon du collecteur. C'est-à-dire que le liquide oral brut et les collecteurs à base de tampon donnent toujours de très faibles concentrations de THC-COOH. Êtes-vous d'accord ?

Je sais que la littérature fait état de THC-COOH dans le fluide oral à environ 15-450 picogrammes/mL. Je sais que pour cette étude, nous n'avons pas été en mesure d'atteindre une LOQ aussi basse et nous ne pensons pas que de nombreux laboratoires seraient capables d'atteindre cette LOQ non plus. Ainsi, si certains laboratoires peuvent être en mesure de quantifier jusqu'à 15 picogrammes/mL, ce niveau de sensibilité nécessite un traitement et une manipulation supplémentaires, ce qui n'est pas très pratique.

Pouvez-vous répéter ce qui est examiné dans l'étude, à part le sang, la bouche et l'haleine ? DRE, distraction iPad, quoi d'autre ?

Les 10 cannabinoïdes sont quantifiés dans le liquide oral, 8 dans le sang et seulement le THC dans l'haleine. Les participants sont évalués au moyen d'un simulateur de conduite, de performances sur iPad et d'examens en aveugle par un ERD de la police. L'obéissance aux ordres verbaux est également évaluée (par exemple, après le troisième feu vert, tourner à gauche).

L'extraction liquide ou diluée et le tournage ont-ils été évalués ?

Non - mais ces approches de prétraitement des échantillons ont été essayées dans d'autres laboratoires. En raison de la présence de stabilisateurs et de tensioactifs dans les dispositifs commerciaux de collecte des fluides oraux, la méthode "diluer et tirer" ne fonctionne pas, car elle entraîne une très forte suppression des ions. L'extraction liquide-liquide ne permet pas non plus de réduire la suppression des ions lorsque le fluide oral est recueilli dans des dispositifs commerciaux.

Quelle est la corrélation entre la déficience mesurée et les niveaux de cannabinoïdes dans le sang/la salive ? Votre étude s'est-elle déjà penchée sur cette question ou cela viendra-t-il plus tard ?

Cela sera fait à la fin de l'étude, lorsque nous aurons 120 participants avec des données complètes, nous lèverons l'aveugle et pourrons alors évaluer quelle concentration de l'un des cannabinoïdes mesurés est associée à la déficience.

Comment assurez-vous l'uniformité des concentrations de cannabinoïdes dans les joints que vous avez fournis aux participants ? Quelles sont les plages de variations ?

Les joints sont roulés par le pharmacien du centre médical UCSD. Le statisticien indique au pharmacien le type de marijuana à utiliser (c'est-à-dire placebo, 5,9 ou 13,4 % de THC), puis le remet au coordinateur du projet, qui le livre au patient. Ainsi, seul le statisticien sait quel participant reçoit quel type de cannabis. La quantité roulée dans le joint est identique entre les types.

Comment intégrer dans l'étude les antécédents de consommation de cannabis de tous les participants ? Comment allez-vous interpréter les résultats ?

Nous ne recrutons que des utilisateurs chroniques (quotidiens) et des utilisateurs occasionnels (>3x par semaine) dans notre étude afin de réduire le biais des utilisateurs naïfs. Pour l'instant, je ne sais pas comment mes collaborateurs vont gérer les différences d'antécédents des utilisateurs.

Comment se passe la propagation de la drogue dans les échantillons de fluide oral ? Nous avons recueilli deux échantillons différents dans deux tubes différents et l'un s'est révélé positif et l'autre négatif pour le THC, pouvez-vous expliquer ?

Nous n'avons pas recueilli assez de données pour vraiment commenter la propagation de la drogue dans les échantillons de fluide oral, mais nous avons vu n'importe où entre 15 ng/mL et >4000 ng/mL de THC après avoir fumé. En supposant que vous parlez de deux appareils différents, il est possible que les tampons propriétaires aient contribué à votre biais.

Comment interpréter la présence d'un des métabolites mais pas de la molécule mère dans l'échantillon de liquide oral ?

Pour l'instant, nous n'avons pas de spéculations sur les interprétations possibles des échantillons, mais cela dit, nous n'avons pas encore eu d'échantillon négatif au THC avec un métabolite positif dans le liquide oral. Il sera donc probablement très rare d'avoir à spéculer sur ce que cela pourrait signifier.

Pourquoi considérez-vous que le THCA-A est si fortement retenu sur la seringue d'Hamilton ?

Je n'ai pas de bonne réponse quant à la raison pour laquelle le THCA-A est fortement retenu sur la seringue Hamilton. Nous avons choisi de ne pas en rechercher la cause, mais plutôt de mettre en œuvre une solution (c'est-à-dire de passer à des embouts de pipette jetables).

Avec le transfert de la seringue Hamilton, avez-vous essayé de laver avec d'autres solvants comme le chloroforme ?

Non, nous n'avons pas essayé de laver avec du chloroforme ou d'autres solvants organiques non polaires.

On ignore beaucoup de choses sur ce qui fait qu'une variété est (par exemple) "énergisante" ou "bloquée". Ces facteurs (par exemple, la composition terpénique) pourraient certainement affecter la capacité de conduire. Comment contrôlez-vous cette variabilité ?

Il est difficile de répondre à cette question car l'ingestion de matériel végétal relève d'une approche polypharmaceutique de la médecine (c'est-à-dire que plusieurs facteurs provoquent une réponse qu'il est difficile d'attribuer à un seul composé). Cependant, le composant psychoactif du cannabis est le THC, donc indépendamment des autres facteurs contributifs, si le THC finit par être associé à la déficience de l'OF à un certain niveau, nous espérons que cela sera vrai pour les différentes souches de plantes. Il s'agit d'une question complexe, mais les recherches futures sur le profilage des souches de plantes sont un sujet qui doit être mieux réglementé et contrôlé afin d'identifier les effets potentiels d'affaiblissement.

Quel type de tâches a été évalué sur l'iPad ?

La tâche de l'iPad consistait à déterminer si le sujet était capable ou non de sélectionner la bulle qui était plus grande que toutes les autres. Le temps mis pour sélectionner la bonne bulle sera évalué.

Notre groupe mesure la fonction/vision rétinienne en cas d'utilisation aiguë, mais n'a pas la capacité de déterminer les produits biologiques. Nous constatons, dans notre ensemble limité de données, des différences " d'usine ". Nos recherches antérieures sur la maladie d'Alzheimer et la maladie de Parkinson ont montré que les erreurs dans les tests neurologiques des comprimés reflètent souvent un dysfonctionnement de la vision plutôt qu'un dysfonctionnement cognitif. Vos méthodes et votre capacité à mesurer de nombreux cannabinoïdes seront importantes. Avez-vous des moyens de déterminer le fonctionnement non cognitif ?

Des commandes verbales sont données aux sujets pour évaluer l'attention qui ne serait pas affectée par un dysfonctionnement de la vision. Cet aspect du projet est supervisé par mes collaborateurs du département de psychologie et il serait préférable de s'adresser à eux car mon expérience est limitée dans ce domaine de recherche.

Des recherches plus anciennes sur la vision (datant des années 70 à Berkeley) ont révélé des courbes de pic et de dissipation similaires aux vôtres, c'est-à-dire un pic autour de 10-15 minutes qui se dissipe en 1,5 heure. Il s'agissait de tests fonctionnels de l'éblouissement rétinien. Est-ce que l'un des tests fonctionnels correspond à ces pics et courbes de dissipation ?

Je suis toujours en aveugle pour tous les tests fonctionnels et mes collaborateurs sont en aveugle pour toutes les valeurs de laboratoire jusqu'à la fin de l'étude.

L'audition et la vision sont dysfonctionnelles en cas de consommation aiguë de marijuana. Huestis rapporte la présence de tunnels - mais aucune étude n'a été identifiée à ce jour. Nous trouvons des tunnels. Rapporté à l'ARVO cette année.

Je suis aveugle aux évaluations fonctionnelles, aux simulateurs et aux résultats de l'examen DRE.

Donc, si le NIH, limité en CBD alors ? Quel est le maximum que le CBD peut obtenir ?

Comme nous obtenons notre marijuana du gouvernement, nous sommes limités quant aux souches et à la puissance que nous pouvons tester. Je ne sais pas quelle est la quantité maximale de CBD disponible auprès des NIH.

Avez-vous envisagé d'utiliser la méthode du décalage temporel puis d'examiner la corrélation entre le sang et l'OF ? Par exemple, si les composés sont absorbés après 15 minutes, utiliser le sang de 15 minutes avec le temps zéro de l'oral ?

Non, nous n'avons pas envisagé de procéder à un décalage temporel de nos données pour le moment. L'analyse des données aura lieu à la fin de l'étude et il est possible que les corrélations s'améliorent une fois que nous aurons stratifié les patients (c.-à-d. déficients vs non déficients ; ou placebo vs faible vs fort THC ; etc.)

Pourquoi seulement de l'IS deutéré ?   

Les étalons internes deutérés sont couramment utilisés pour les métabolites cannabinoïdes. Les étalons internes 13C pourraient être potentiellement utilisés.

 

N'oubliez pas de consulter le webinaire à la demande.

 

En savoir plus sur les technologies de Waters pour les applications de toxicologie médico-légale: