Surveillance multi-attributs : Le rôle grandissant de la spectrométrie de masse dans l'analyse des sous-unités des AcM

Les laboratoires biopharmaceutiques découvrent que l'analyse des sous-unités permet d'augmenter le débit des tests de contrôle multi-attributs robustes.

La technologie de la spectrométrie de masse a été cruciale et largement appliquée dans l'analyse des médicaments biothérapeutiques car elle peut détecter et mesurer une grande variété d'attributs de qualité des produits et des processus avec une grande sélectivité et sensibilité, tels que les clips, la glycosylation, la glycation, l'oxydation, la désamidation, les variantes de séquence, etc.

Les tests de surveillance multi-attributs (MAM) basés sur les technologies LC-MS ont gagné en popularité ces dernières années car ils permettent aux chercheurs de détecter et de mesurer simultanément plusieurs attributs de qualité, ce qui permet des flux de travail analytiques plus rationalisés et plus productifs.

Deux approches MAM pour l'analyse biothérapeutique sont mises en œuvre aujourd'hui :

• Analyse de la masse des sous-unités d'anticorps monoclonaux (mAb)
• Analyse de peptides à partir d'un digest de protéines (flux de travail de cartographie peptidique)

Les deux ont leurs avantages et leurs inconvénients. Le choix de l'approche à adopter dépend réellement de la molécule et des attributs à analyser, ainsi que des objectifs de l'organisation de développement et de fabrication.

En général, les flux de MAM basés sur les peptides offrent une plus grande sensibilité et sont de plus en plus évalués, mais les analyses basées sur les sous-unités d'AcM sont plus rapides et plus faciles à exécuter. Elles sont utilisées depuis des années pour soutenir le développement de produits et de processus, ainsi que dans les essais de libération validés par le CQ.^{1, 2}

Dans un récent article de synthèse, des scientifiques de Roche décrivent un test ESI-MS à sous-unité réduite QTof pour évaluer la variation de la glycosylation de Trastuzumb, qu'ils ont mis en œuvre pour la première fois en 2004, et pour lequel des données provenant de plus de 500 lots de médicaments ont été obtenues avec seulement trois déviations de l'adéquation du système depuis le début.

Analyse de la masse des sous-unités : De la caractérisation au contrôle des attributs et au contrôle de la qualité

La préparation des échantillons pour l'analyse de la masse des sous-unités de l'AcM commence par une digestion enzymatique (généralement avec de la pepsine ou des Ides) et/ou une réduction de l'AcM thérapeutique, ce qui génère trois fragments de sous-unités primaires (LC, Fd', scFc) qui peuvent ensuite être rapidement séparés et analysés par LC-MS. Les résultats MS déconvolués peuvent être utilisés pour fournir une mesure semi-quantitative de différents attributs de qualité, tels que la glycosylation, l'oxydation, le variant de séquence du clipand, etc.

Compte tenu de la préparation relativement simple et robuste des échantillons et de la rapidité de l'analyse LC-MS, l'analyse des sous-unités est devenue une méthode de choix non seulement pour la caractérisation, mais aussi pour le contrôle des attributs à haut débit afin de soutenir le développement et la fabrication des produits/processus.

Les scientifiques d'Eli Lilly ont utilisé une approche rapide de LC-MS des sous-unités3 pour caractériser d'abord les schémas de glycosylation N-liée dans le domaine Fab (liaison de l'antigène au fragment), indépendamment de la glycosylation canonique trouvée dans le domaine Fc.³ En utilisant cette méthode semi-quantitative, ils ont démontré l'impact de la glycosylation du Fab et du Fc sur la clairance, et ont identifié les oligosaccharides Fab contenant du GlcNAc terminal et du M6P comme des attributs de qualité critiques (AQC) qui doivent être correctement contrôlés.

L'approche d'Eli Lilly a permis d'obtenir des données rapides et précises sur le profilage de la glycosylation pendant le développement du produit et a été utilisée pour élaborer une stratégie de contrôle intégrée afin de garantir la qualité du produit. Dans une présentation ultérieure lors d'un atelier USP 2015 sur l'analyse de la glycosylation pour les produits biopharmaceutiques, ils ont décrit le développement de ce test et détaillé leur validation ICH de cette approche comme test de libération candidat pour leur biothérapeutique.

Déploiement de l'analyse à haut débit des sous-unités pour la MAM en cours de processus

Grâce à un flux de travail rationalisé, disponible dès à présent dans le cadre d'une informatique prête à être mise en conformité avec les BPF pour automatiser l'acquisition, le traitement et le rapport des données LC-MS^{,4, 5} les analyses de sous-unités d'AcM peuvent être facilement mises en œuvre dans des environnements de laboratoire réglementés et non réglementés, soutenant la caractérisation des produits, la surveillance des attributs pour le développement et l'optimisation des produits et des processus, et même la validation du CQ.

Des scientifiques de Janssen ont récemment fait part de leur réussite dans la mise au point d'une méthode de surveillance multi-attributs très sensible et reproductible6 avec purification de protéines à haut débit suivie d'une analyse rapide de la masse des sous-unités. Grâce à cette méthode de plateforme, de multiples attributs du produit, notamment l'aglycosylation, la glycosylation et la glycation, ont été quantifiés simultanément dans une série d'études DOE (Design of Experiment) à petite échelle, et des corrélations entre les niveaux de ces attributs de qualité et des paramètres particuliers du processus de culture cellulaire ont été efficacement établies.

Les auteurs de Janssen ont déclaré : "Cette méthode élargit considérablement les possibilités de l'analyse LC-MS pour le contrôle en cours de fabrication."

Les scientifiques de Janssen ont souligné le potentiel de la méthode MAM en tant que "stratégie efficace de contrôle par rétroaction en temps réel qui peut améliorer considérablement la robustesse de la production, la rentabilité de la fabrication et la qualité des produits dans le développement biopharmaceutique".

Dans une seconde étude publiée par les scientifiques de Janssen. a mis en évidence l'avantage d'appliquer une méthode MAM basée sur les sous-unités⁷ pour évaluer les profils d'oxydation a été mis en évidence. À l'aide d'un système UPLC-MS de Waters, en particulier le système Solution de plateforme biopharmaceutique avec UNIFIIls ont démontré la reproductibilité et la précision intermédiaire de la méthode et ils ont qualifié et validé le système pour une utilisation dans un environnement GMP, montrant l'applicabilité de cette plateforme dans des environnements de développement avancé et de CQ.

La MAM basée sur les sous-unités présente de nombreux avantages, mais elle est limitée dans sa capacité à surveiller les petits changements de masse qui accompagnent les modifications telles que la désamidation et l'isomérisation, et elle n'est pas en mesure de générer des informations spécifiques au site lorsque plusieurs modifications sont situées sur le même fragment de sous-unité.

Pour ces situations, les analyses basées sur les peptides sont considérées comme des flux de travail complémentaires.

Le prochain article de ma série portera sur le MAM basé sur la cartographie peptidique.

Lire la première partie de la série : De la caractérisation au développement tardif, à la fabrication et au CQ : Le rôle croissant de la spectrométrie de masse dans les biothérapies

Références :

1. Firth et. al. Évaluation orthogonale de la glycosylation des produits biothérapeutiques : Une étude de cas corrélant l'afucosylation du noyau du N-Glycane de l'Herceptin avec le mécanisme d'action. Anal Chem. 2016, 88, 10259-10265
2. Haberger et. al. Application de la spectrométrie de masse à ionisation par électronébulisation dans un laboratoire de contrôle de la qualité. Am Pharm Review. 2016, 19(5)
3. Huang et al. Impact of variable domain glycosylation on antibody clearance : an LC/MS characterization. Anal Biochem. 2006, 349 (2) : 197-207
4. Henry Shion et al. Solution de plate-forme biopharmaceutique avec UNIFI : Rationalisation de l'analyse de masse intacte conforme et non conforme des AcM biothérapeutiques
5. Ranbaduge et. al. Caractérisation automatisée de la modification des protéines du standard de référence d'anticorps monoclonal intact et sous-unitaire du NIST avec le système d'information scientifique UNIFI de Waters
6. Dong et al. Plateforme automatisée de purification de la protéine A à haut débit avec analyse LC-MS multi-attributs pour la surveillance avancée des processus de culture cellulaire. Chem. 2016, 88, 8673-8679
7. Sokolowska et al. Analyse de la masse des sous-unités pour le suivi de l'oxydation des anticorps. mAbs, 2017, 0, 1-8.