Comment les technologies analytiques soutiennent le développement des médicaments biosimilaires

Scott Berger

Temps de lecture : 10 minutes

Les progrès de l'analyse à haute résolution pour la caractérisation des produits thérapeutiques innovants et biosimilaires

Alors que l'industrie pharmaceutique continue de passer des médicaments à petites molécules à des portefeuilles de produits équilibrés comprenant des protéines thérapeutiques, les chimistes analytiques sont de plus en plus mis au défi de produire des flux de travail de caractérisation routiniers et automatisés qui permettent aux produits biopharmaceutiques innovants et biosimilaires de progresser dans leur développement et leur commercialisation.

Les médicaments biothérapeutiques tels que les anticorps monoclonaux (mAbs) sont hétérogènes.

Introduction

Les produits biothérapeutiques sont des produits très complexes et hétérogènes qui sont fondamentalement différents des médicaments synthétiques à petites molécules hautement purifiés - par leur taille, leur complexité, leur mode de fabrication et les données nécessaires pour démontrer leur similarité.

Un grand nombre de ces produits biothérapeutiques complexes, qui sont le résultat d'années de recherche pionnière et de processus de fabrication complexes, ne sont plus protégés par un brevet, ce qui crée une opportunité difficile mais génératrice de milliards de dollars pour l'introduction de versions biosimilaires de produits innovants, à mesure que les brevets de médicaments biologiques expirent.

Les protéines biothérapeutiques deviennent un segment de plus en plus important de l'industrie pharmaceutique, ce qui oblige les scientifiques dont la carrière analytique a été investie dans les laboratoires pharmaceutiques traditionnels de petites molécules à se tourner vers la caractérisation et l'analyse de grandes molécules.

Les fournisseurs de technologies de chromatographie et de spectrométrie de masse ont donc été amenés à concevoir des instruments, des logiciels et des flux de travail spécialement conçus pour les études d'analyse des protéines, plus accessibles et plus automatisés pour l'acquisition, le traitement et le compte rendu des études de caractérisation et de comparabilité requises pour l'approbation des produits innovants et biosimilaires.

Dans cette série en trois parties, nous allons examiner comment les technologies analytiques LC et MS se combinent avec les logiciels et l'informatique pour faciliter le développement des biosimilaires à trois niveaux :

Qu'est-ce que la biosimilarité ?

Commençons par les principes de base. Étant donné que de nombreuses caractéristiques des médicaments biothérapeutiques sont uniques et dépendent d'un processus de fabrication spécifique, on ne peut attendre des produits biosimilaires qu'ils démontrent une similarité avec un produit biothérapeutique de référence, plutôt que de produire un modèle identique de variation du produit.

Les voies d'approbation réglementaires existantes pour les médicaments génériques à petites molécules ne s'appliquent pas à l'approbation des biosimilaires, en raison de leur complexité inhérente. La similarité entre un biosimilaire et son produit biothérapeutique de référence doit être évaluée en termes de qualité, de sécurité et d'efficacité.

En fait, les régulateurs se rendent compte qu'avec les médicaments biologiques, même d'un lot à l'autre provenant du même fabricant, un produit identique ne sera pas produit. Nous disons donc que le produit de référence est très similaire d'un lot à l'autre et que l'on s'attend à ce que le producteur du biosimilaire produise quelque chose dans cette plage de variation.

Selon la section 351 de la FDA américaine, biosimilaire signifie "que le produit biologique est hautement similaire au produit de référence, nonobstant des différences mineures dans les composants cliniquement inactifs ; et qu'il n'y a pas de différences cliniquement significatives entre le produit biologique et le produit de référence en termes de sécurité, de pureté et de puissance du produit".

Qu'est-ce que cela signifie pour les chimistes analytiques ? Alors que des différences seront analytiquement détectables entre les lots de produits biothérapeutiques innovateurs et biosimilaires, le développeur d'un biosimilaire devra établir que les attributs critiques du produit se situent dans la fourchette de l'historique du produit innovateur, ou que les changements en dehors de la fourchette historique ne sont pas cliniquement significatifs pour la sécurité, la pureté ou la puissance.

La FDA reconnaît l'importance des technologies analytiques LC et MS dans la définition de ces attributs de qualité critiques. Fin 2016, la FDA a examiné l'impact des technologies LC et MS dans un article du JASMS intitulé "Une évaluation rétrospective de l'utilisation de la spectrométrie de masse dans les demandes de licence de produits biologiques de la FDA. "

En Europe, l'EMA a publié des lignes directrices similaires pour les biosimilaires, indiquant que "des études de caractérisation approfondies et à la pointe de la technologie doivent être appliquées au biosimilaire et au médicament de référence (princeps) en parallèle, afin de démontrer avec un haut niveau d'assurance que la qualité du biosimilaire est comparable au médicament de référence."

Il reste donc à la charge du producteur de biosimilaires d'évaluer la portée et la pertinence de toute étude de caractérisation à mener.

Alors que les attentes réglementaires sont mieux définies dans les marchés développés et que la demande d'accès à des biothérapies sûres et efficaces augmente dans les marchés émergents, les opportunités sont mûres pour que les biosimilaires connaissent une croissance accélérée du marché, les prévisions suggérant que le marché mondial des biosimilaires pourrait atteindre 35 milliards de dollars d'ici 2020.

Le défi de la création d'un biosimilaire

Le développement d'un biosimilaire commence par une caractérisation complète du produit innovateur afin de détailler les attributs structurels clés qui se traduiront en spécifications pour un produit biosimilaire.

Étant donné que le produit d'origine présente une variation inhérente d'un lot à l'autre et que les attributs peuvent changer au fil du temps et des cycles d'amélioration du processus, les attributs de qualité doivent être évalués sur plusieurs lots (un historique de deux ans de lots a été mentionné de manière anecdotique lors de réunions industrielles) afin de définir la variation du produit d'origine pour établir les spécifications du biosimilaire.

Une fois que le produit innovateur ciblé est compris, un processus de production pour un biosimilaire peut être conçu pour atteindre les spécifications de l'innovateur. Les données typiques de ces études détailleront les attributs de la structure primaire (séquence et modifications), les profils de dégradation, les études de structure d'ordre supérieur, y compris l'agrégation, et les profils d'impuretés de la protéine de la cellule hôte.

Savoir-faire en matière de caractérisation des biosimilaires

La solution de plateforme biopharmaceutique avec le logiciel UNIFI, comprenant un Bio ACQUITY UPLC H-Class et un spectromètre de masse Xevo G2-XS QTof.
La solution de plateforme biopharmaceutique avec le logiciel UNIFI, qui comprend le système ACQUITY UPLC H-Class Bio, le spectromètre de masse Xevo G2-XS QTof, ainsi que des préparations d'échantillons, des normes analytiques et des colonnes adaptées aux grandes molécules.

Waters travaille depuis plus de 10 ans à la mise au point d'une technologie analytique et d'une informatique axées sur l'industrie biopharmaceutique, qui aident les analystes à relever les défis de caractérisation et de comparabilité posés par les autorités réglementaires pour l'approbation des produits innovants et des biosimilaires.

Aujourd'hui, notre solution de plateforme biopharmaceutique avec UNIFI combine les flux de travail critiques nécessaires à l'analyse des médicaments biothérapeutiques et biosimilaires.

Cette plateforme d'analyse à haute résolution est configurable pour prendre en charge les environnements de laboratoire biopharmaceutique qui fonctionnent dans des environnements de découverte/de début de développement ainsi que ceux de développement ultérieur fonctionnant sous des exigences de conformité strictes.

Fondamentalement, le logiciel UNIFI peut être déployé dans toute une organisation biothérapeutique, de la découverte des médicaments au contrôle de la qualité. La plateforme modernise la façon dont les laboratoires acquièrent, partagent et communiquent les données ; toutes les données peuvent être stockées sur un serveur central et accessibles à partir de PC clients.

Aujourd'hui, les groupes de travail UNIFI peuvent être configurés pour prendre en charge jusqu'à deux systèmes UPLC/MS et quatre systèmes UPLC supplémentaires avec détection optique uniquement. À l'avenir, des déploiements d'entreprise complets permettront d'étendre ces capacités à plusieurs laboratoires et à des sites géographiques différents.

Étude de cas : Une étude de comparabilité de l'infliximab à l'aide du logiciel UNIFI

Waters a utilisé la solution de plate-forme biopharmaceutique avec UNIFI pour mener une étude de comparabilité des modèles entre un nouveau candidat biosimilaire et l'anticorps monoclonal innovateur ciblé, l'infliximab(Remicade).

Remicade est un médicament à succès, commercialisé par Johnson & Johnson, dont les ventes aux États-Unis ont atteint 4,5 milliards de dollars en 2015. Le médicament est un bloqueur du TNF et est actuellement utilisé pour traiter les troubles auto-immuns tels que la maladie de Crohn et la polyarthrite rhumatoïde. Ses brevets européens ont expiré, ouvrant la voie à la concurrence des biosimilaires, et des brevets américains clés devraient expirer en 2018.

En septembre 2013, les deux premiers biosimilaires de l'infliximab de Celltrion (Remsima) et Hospira (Inflectra) ont été approuvés en Europe. Des données positives de phase 3 ont également été rapportées par la société américaine EPIRUS Biopharmaceuticals pour un candidat biosimilaire de l'infliximab, BOW015, qui avait démontré une "comparabilité clinique" avec Remicade, mesurée par la réponse ACR20 chez des patients atteints de polyarthrite rhumatoïde sévère. EPIRUS a indiqué à l'été 2014 qu'il avait reçu les autorisations finales de commercialisation et de fabrication en Inde par le DCGI. Cet essai de phase 3 n'a pas non plus montré de différences significatives entre BOW015 et Remicade en matière de sécurité ou d'immunogénicité.

Celltrion a soumis à la FDA américaine une demande de biosimilaire d'infliximab pour son produit Remsima, qui a été approuvée au printemps 2016. Il s'agit de la première demande d'anticorps monoclonal (mAb) à être évaluée aux États-Unis dans le cadre de l'Affordable Care Act. Pfizer a annoncé la disponibilité aux États-Unis de son biosimilaire Inflectra (infliximab-dyyb) à l'automne 2016. Ces lancements de biosimilaires en 2016 sont suivis de près par l'industrie.

Biosimilaires d'infliximab : Comparaison analytique

Dans l'étude de comparabilité biosimilaire suivante de l'infliximab réalisée par des scientifiques de Waters, trois lots d'infliximab innovant (produit dans la lignée cellulaire murine SP2/0) et trois lots d'un infliximab biosimilaire candidat (dérivé de cellules CHO) ont été comparés à l'aide de la solution de plateforme biopharmaceutique de Waters avec UNIFI.

Les échantillons ont été analysés au niveau de la protéine intacte, des sous-unités protéiques, de la digestion des protéines, de la fraction de glycanes libérés, ainsi que pour les profils d'agrégation et de variantes de charge. Dans la plupart des flux de travail, chacun des six échantillons a été analysé en trois exemplaires pour établir la reproductibilité analytique de base.

La confirmation de la structure primaire (c'est-à-dire la séquence) est fondamentale pour établir la biosimilarité avec un produit innovant.

Cette question peut être abordée indirectement au niveau des études d'analyse de masse des anticorps intacts et des sous-unités d'anticorps, mais elle nécessite des études de cartographie peptidique à haute couverture pour démontrer l'ordre linéaire des acides aminés au sein des chaînes protéiques.

Ces analyses servent également à définir la variation du produit pour des attributs tels que la glycosylation, le traitement terminal et d'autres modifications des protéines.

 

Partie 1 : Protéines intactes

Analyse de la masse intacte

Une première étape raisonnable dans toute évaluation d'IgG est une mesure de la masse intacte qui peut confirmer la masse moléculaire théorique et établir le profil des modifications de masse plus élevée (par exemple, la glycosylation, les variantes Lys C-terminales). Il s'agit d'une expérience simple et rapide avec une préparation minimale de l'échantillon, mais qui peut fournir une grande quantité d'informations ; elle peut rapidement disqualifier les clones produisant un candidat biosimilaire qui contiennent des erreurs de séquence, ou qui ont des profils de modification fondamentalement altérés par rapport à l'innovateur.

Les échantillons d'infliximab intacts ont d'abord été analysés par une analyse UPLC/QTof MS en phase inverse à dessalage rapide afin de générer des profils de masse intacts comparatifs entre les échantillons de l'innovateur et du biosimilaire. L'analyse a démontré une masse cohérente pour une glycoforme commune trouvée dans l'innovateur et le biosimilaire, mais a montré des preuves de différences dans les profils de lysine terminale et de glycosylation.

De telles différences ne disqualifient pas un candidat biosimilaire, mais mettent au défi l'organisation biosimilaire de montrer que les observations sont dans la variabilité de l'historique de production, ou n'affectent pas la sécurité, la stabilité ou l'efficacité de la molécule.

En utilisant le mode comparatif d'UNIFI Software pour l'examen des données et l'établissement de rapports, nous avons pu comparer visuellement les résultats de cette étude, puis nous avons appliqué les modèles de rapports prédéfinis d'UNIFI pour automatiser la documentation de nos résultats sur l'abondance relative de toutes les lysines et glycovariants détectés.

Au niveau de la masse intacte, il est possible de réduire la complexité du résultat de la masse intacte en utilisant des enzymes pour éliminer les structures de N-glycane, ou pour éliminer les résidus de lysine de la chaîne lourde C-terminale.

L'élimination de la chaîne lourde déglycosylée a démontré que les lots de l'innovateur avaient environ 40 % de lysines résiduelles, tandis que le candidat biosimilaire avait des niveaux de lysine de 60 ou 70 %. Ce niveau était constant d'un lot à l'autre et d'une injection à l'autre, établissant des attentes quant à la reproductibilité de ce type de test de profilage, en plus d'établir la similarité d'un lot à l'autre dans et entre chaque échantillon.

L'élimination des lysines C-terminales de la chaîne lourde par digestion avec la carboxypeptidase B permet de profiler les glycovariants avec plus de clarté. Malheureusement, la carboxypeptidase a coeluché avec le mAb traité aux lysines lors de l'analyse en phase inversée, si bien que la SEC/UV/MS dénaturante a été appliquée pour examiner les échantillons après traitement.

Waters a mis au point une méthode SEC/UV/MS dénaturante de 10 minutes (présence d'organique et d'acide) pour obtenir une séparation de base de l'infliximab/biosimilaire candidat traité à la carboxypeptidase B de l'enzyme et des sels.

Dans le logiciel UNIFI, le graphique en miroir des données résultantes a révélé que les principales masses de glycoformes étaient cohérentes entre les échantillons de l'innovateur et du biosimilaire, mais que les niveaux de glycovariants étaient différents dans l'infliximab biosimilaire par rapport à l'innovateur. Notamment, le niveau de la glycoforme défucosylée, G0, était plus élevé dans l'infliximab biosimilaire, tandis que les niveaux de glycoformes MAN5 et G0F-GlcNAc étaient relativement plus élevés dans l'échantillon innovateur.

Voir la méthode et les données de notre comparaison structurelle de l'infliximab et d'un biosimilaire via l'analyse des sous-unités.

Analyse des sous-unités : Analyse de masse réduite par LC et HC

Pour simplifier la complexité causée par le profilage de deux ensembles de glycoformes de chaîne lourde au niveau de la protéine intacte, et pour mieux profiler les glycoformes de moindre abondance, nous avons réduit (traitement au DTT) l'anticorps aux fragments LC et HC, et nous les avons analysés par une méthode LC/MS résolutive (colonne BEH C4 ACQUITY UPLC, phase inversée) pour comparer les profils de masse des échantillons innovateurs et biosimilaires.

Les spectres de masse déconvolués ont montré que la masse de la chaîne légère du biosimilaire candidat était cohérente avec celle de l'infliximab innovant ; les pics spectraux déconvolués par MaxEnt 1 pour la CL des lots des deux échantillons ont révélé des masses cohérentes dans les limites de l'erreur expérimentale. Aucun signe de glycosylation ou d'autres modifications importantes n'a été observé dans les profils de la chaîne légère, et les pics de niveau inférieur dans les spectres déconvolués étaient cohérents entre l'innovateur et le biosimilaire candidat.

Les spectres de masse déconvolués des chaînes lourdes de l'innovateur et de l'infliximab biosimilaire candidat ont à nouveau montré que les masses des chaînes lourdes du biosimilaire candidat étaient cohérentes avec celles de l'innovateur, mais que les niveaux des variants glyco et lysine étaient différents, comme cela a été vu pour la première fois dans l'analyse intacte.

 

Suivant : Analyse au niveau des peptides

 

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