Développement de méthodes de séparation pour les produits naturels : Questions et réponses d'un webinaire avec le Dr. Tom Wheat

Brian Murphy

Temps de lecture : 4 minutes

Le développement de méthodes chromatographiques pour les produits naturels est un défi en raison de la complexité de la matrice de l'échantillon et de la chimie de l'analyte. Cependant, en comprenant les paramètres fondamentaux de votre chromatographie et les stratégies de détection efficace, il existe de nombreuses façons de surmonter ces difficultés.

J'ai récemment présenté un webinaire décrivant certaines techniques et certains outils utilisés pour développer des méthodes de séparation pour les produits naturels. La séance a suscité de nombreuses questions intéressantes et une discussion considérable. Je partage les réponses à ces questions en sachant que d'autres en profiteront également.

Séminaire sur le blé
Webinar : Développement efficace de méthodes de séparation pour des échantillons complexes de produits naturels, présenté par le Dr. Tom Wheat, scientifique principal, Waters Corporation.
  1. Des normes sont-elles nécessaires pour juger de la pureté des pics et pour le suivi des pics ?

Non, il n'est pas nécessaire de disposer d'étalons pour la pureté et le suivi des pics. Si vous aviez des normes, vous les utiliseriez, bien sûr. Mais le plus souvent, nous utilisons une procédure de catalogage. Dans chaque expérience chromatographique, nous enregistrons le spectre de masse et le spectre UV pour chaque pic. Nous recherchons ensuite les spectres correspondants dans les autres expériences chromatographiques. Souvent, nous observons un pic avec un spectre que nous n'avions pas observé lors d'une expérience précédente. Nous revoyons alors l'expérience précédente pour rechercher explicitement ce composé. Nous construisons de manière itérative un catalogue ou une bibliothèque des composants de l'échantillon. Nous pouvons ensuite faire correspondre ces caractéristiques spectrales lorsque nous modifions les caractéristiques du milieu de séparation. Cela peut conduire à une carte de rétention pour chaque analyte qui peut être utilisée pour contrôler le développement de la séparation.

  1. Vous arrive-t-il d'intégrer d'autres détecteurs dans un système de développement de la séparation ?

Lorsque nous effectuons des séparations, ou tout autre type de travail analytique avec un échantillon de produit naturel totalement inconnu, nous devons toujours nous demander si nous n'avons pas manqué quelque chose. Nous incorporons régulièrement des détecteurs orthogonaux dans notre système de séparation. Il est essentiel que nous choisissions chacun des multiples détecteurs comme représentant un principe physique ou chimique différent. La combinaison d'un détecteur UV et d'un détecteur de masse répond à ce critère. Il est très courant d'ajouter un troisième détecteur, le plus souvent un détecteur de diffusion de la lumière par évaporation, au système. L'éluat de la colonne est réparti entre ces trois détecteurs, de sorte que nous pouvons également détecter des composés qui n'ont aucune absorbance UV et aucune ionisation.

  1. Les méthodes que vous concevez selon ces principes peuvent-elles être utilisées pour isoler les composés d'intérêt ?

Oui. Nous choisissons cependant de n'utiliser que des composants volatils de la phase mobile pour développer la séparation. Il est ainsi plus facile de récupérer le matériel collecté en évaporant ou en lyophilisant simplement la fraction. Nous choisirions de toute façon ces phases mobiles si nous incorporions la spectrométrie de masse ou la détection par diffusion de lumière par évaporation. Nous essayons généralement d'obtenir une résolution plus complète si la méthode doit être utilisée pour l'isolement, afin de pouvoir augmenter la charge d'échantillons sans compromettre la pureté. Cela nous permettrait également d'adapter la méthode à des particules de plus grande taille pour une meilleure économie avec des échantillons plus importants.

  1. Pour le dépistage des inconnues, serait-il utile d'utiliser 50 % de méthanol, 50 % d'acétonitrile (avec acide formique) comme phase mobile B ?

L'utilisation de mélanges de solvants organiques est une pratique bien établie qui a fait ses preuves. Il peut cependant être difficile de réaliser les expériences de développement de manière systématique et contrôlée. J'ai utilisé un protocole avec une série d'expériences. L'échantillon est d'abord analysé, par exemple, dans de l'acétonitrile à 100%. Puis une série d'expériences est exécutée avec 67% d'acétonitrile/33% de méthanol, 67% de méthanol/33% d'acétonitrile et 100% de méthanol. Ces quatre expériences permettent de reconnaître l'effet des proportions changeantes du mélange de solvants sur la sélectivité de la séparation. Vous pouvez choisir un point intermédiaire pour la meilleure séparation d'une manière systématique. Pour ces expériences, il est plus pratique d'utiliser un système de distribution de plusieurs solvants. Les quatre solvants peuvent être mélangés à la demande et il n'est donc pas nécessaire de préparer manuellement toutes les différentes phases mobiles.

Ces points de discussion couvrent le large éventail des principes analytiques appliqués aux méthodes de séparation des produits naturels. Le développement réussi de ce groupe d'essais nécessite une attention particulière au contrôle de la chromatographie et aux modes de détection, ainsi qu'à l'interprétation des résultats. Bien que les produits naturels représentent une classe d'échantillons particulièrement difficile, les idées discutées ici peuvent être appliquées à un large éventail de types d'échantillons.

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