Éviter la pénurie de réactifs pour la PCR : Le rôle des colonnes HPLC préparatives

Nick Zampa

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Temps de lecture : 6 minutes
Sonde d'amorce PCR

Sonde d'amorce PCRLes diagnostics critiques basés sur la PCR du SRAS-CoV-2 n'ont pas été à l'abri de la les perturbations de la chaîne d'approvisionnement si fréquente pendant la pandémie de COVID-19. Alors que le La plus grande perturbation pour les tests basés sur la PCR Les kits d'extraction d'ARN, les enzymes et les amorces PCR ont également été touchés. Chez Waters, nous avons gardé un œil attentif sur le rôle que jouent les colonnes HPLC préparatives de haute qualité dans la chaîne d'approvisionnement en amorces et sondes PCR. Au fur et à mesure que nous avancerons dans cette pandémie et au-delà, nous continuerons à contribuer à assurer une qualité et un approvisionnement adéquats en amorces et sondes PCR pour le diagnostic et l'utilisation de routine.

Contexte des amorces et des sondes de RT-PCR

Le diagnostic rapide de l'infection virale SRAS-CoV-2 a été primordial pour gérer la nouvelle pandémie de coronavirus. En fait, COVID-19 nous a appris que la disponibilité rapide de diagnostics de qualité est essentielle à la réussite de la gestion des pandémies en général.

De nombreux tests COVID-19 bénéficiant d'une autorisation d'utilisation d'urgence aux Etats-Unis et dans l'UE utilisent des kits de diagnostic RT-PCR, qui utilisent des oligonucléotides comme amorces et sondes pendant l'amplification et la détection.

  • Sondes RT-PCR fluorescentes (double marquage): Les sondes RT-PCR sont des oligonucléotides qui se lient à une séquence cible spécifique d'intérêt. Un fluorophore rapporteur est attaché à l'extrémité 5' de la sonde, tandis qu'un quencher est attaché à l'extrémité 3'. La proximité du quencher et du fluorophore inhibe le signal fluorescent. Pendant l'amplification, une transcriptase inverse transcrit l'ADN de l'extrémité 5' à l'extrémité 3'. Cela libère le fluorophore de la sonde et du quencher, ce qui entraîne un signal fluorescent mesurable.
  • Amorces PCR: Les amorces PCR sont de courts oligonucléotides monocaténaires qui se fixent en amont de la séquence cible d'intérêt. Les ADN polymérases, y compris la transcriptase inverse, ne peuvent que transcrire l'ADN d'un brin existant dans le sens 5' vers 3', et ne peuvent pas créer un nouvel ADN à partir d'un brin matrice seul. Ainsi, des amorces oligonucléotidiques sont nécessaires pour une réaction PCR.

Colonnes HPLC préparatives et diagnostics RT-PCR

Comprendre l'importance des colonnes HPLC préparatives pour la fabrication de diagnostics RT-PCR peut être divisé en deux questions.

Quel est le paramètre de performance le plus important pour un test de diagnostic RT-PCR pendant une pandémie ?

C'est la sensibilité !

Il est essentiel d'éviter les faux négatifs en cas de pandémie. Le contrôle de la propagation de la maladie exige que nous ne diagnostiquions pas à tort des patients comme n'étant pas atteints de la maladie, alors qu'ils le sont en réalité. Par conséquent, le paramètre de performance le plus important pour un test de diagnostic est la sensibilité. La sensibilité analytique et des limites de détection (LdD) suffisamment basses sont nécessaires pour garantir un minimum de faux négatifs.

Amorce PCR Sonde 2

Alors, quel est le rapport entre les colonnes HPLC préparatives et la sensibilité ?

C'est une question de pureté !

Comme je l'ai appris en discutant avec les collaborateurs de nos clients, la purification par HPLC en phase inversée (principalement par appariement ionique) est recommandée pour obtenir la pureté des amorces et des sondes nécessaire à la réalisation de tests de diagnostic basés sur la PCR suffisamment sensibles et précis. Un trop grand nombre de séquences d'échec N-1 entraîne une réduction de la sensibilité. La mauvaise base dans votre amorce et elle n'est pas spécifique à la cible d'intérêt. Un marqueur fluorescent libre et votre bruit de fond augmente. Un fluorophore ou un quencher manquant dans un pourcentage de sondes et la sensibilité peut être réduite.

Bien que les exigences en matière de pureté varient d'un test à l'autre et d'une entreprise à l'autre, une pureté supérieure à 85 % est souvent demandée. En effectuant une recherche rapide auprès de certains des principaux fabricants mondiaux d'oligonucléotides, vous trouverez des conseils d'experts sur les techniques de purification des différents types d'amorces et de sondes PCR. Presque universellement, la purification par HPLC est recommandée pour les tests PCR sensibles, notamment ceux utilisés pour le diagnostic.

En définitive, les fabricants de kits de diagnostic cherchent à réduire le risque d'échec de l'amplification PCR dû à des amorces et des sondes de mauvaise qualité ou impures. Si la performance diagnostique est une combinaison de paramètres allant au-delà de la pureté, la pureté est un facteur qui peut être contrôlé dans la conception du kit de test.

Colonnes HPLC préparatives de Waters et fourniture d'amorces et de sondes PCR

Nous pouvons aborder le lien entre l'approvisionnement en amorces et sondes PCR et les colonnes HPLC préparatives de Waters en répondant à trois questions.

Quel est le lien entre les colonnes HPLC préparatives et les chaînes d'approvisionnement en amorces/sondes ?

En permettant aux fabricants de répondre aux exigences de pureté élevée des sondes PCR de diagnostic, les colonnes préparatoires RP-HPLC sont un élément essentiel pour assurer un approvisionnement adéquat en diagnostics sensibles basés sur la PCR pour le COVID-19. Pour cette raison, il est souhaitable d'utiliser des colonnes de haute qualité, capables d'atteindre la pureté requise et de fournir un rendement suffisant. La CLHP est souvent préférée aux formats à cartouches en raison de la plus grande capacité et de la meilleure résolution (résultant en une meilleure pureté) associées aux colonnes. Cette combinaison d'une capacité et d'une pureté supérieures peut être essentielle pour produire d'urgence du matériel à forte demande en cas de pandémie.

OK, alors qu'est-ce qui pourrait mal se passer avec la purification et qui pourrait avoir un impact sur mon approvisionnement ?

  • Imaginez une colonne qui se vide de façon imprévisible ou qui tombe en panne au milieu de la course. Vous perdez votre série. Vous perdez vos échantillons. Vous êtes retardé.
  • Imaginez que vous ayez développé votre méthode à l'échelle analytique, que vous ayez appliqué de bonnes règles de mise à l'échelle, et que soudain, les performances à l'échelle préparative soient un cauchemar. Retour à la planche à dessin. Plus de retard.
  • Imaginez que vous recevez une nouvelle colonne provenant du même lot ou d'un lot différent d'une colonne précédente. Vous commencez votre analyse et vous remarquez que les performances ne sont pas les mêmes. Vous devrez peut-être redévelopper ou optimiser votre méthode pour tenir compte de cette variabilité accrue. Encore un retard.
  • Imaginez que vous commandez une colonne et que votre fournisseur vous informe de retards de livraison. Ce matériel sera-t-il jamais disponible ?

Les retards de production peuvent entraîner des retards dans les tests des patients. En cas de besoin urgent, vous n'avez pas le temps de faire face à ces défis. Vous voulez que tout soit parfait du premier coup, à chaque fois.

Super, mais que peut offrir Waters pour m'aider à respecter mes délais ?

Chez Waters, nous nous efforçons de réduire votre exposition au risque de ces défaillances en vous fournissant des solutions de haute qualité, innovantes et disponibles. Fournir une assurance contre chaque défi ci-dessus nécessite une solution dédiée.

  • Pre vide et des durées de vie courtes : Un lit tassé doit être suffisamment dense pour résister aux forces de compression du fluide rencontrées lors de son utilisation. Au fur et à mesure que le diamètre des colonnes augmente, il est de plus en plus difficile d'atteindre la densité du lit requise pour une performance stable à long terme. En employant la technologie OBD™ brevetée et les processus de conditionnement, nous pouvons conditionner des colonnes pour chaque type et géométrie de particules avec des densités prévisibles et uniformes sur toute la longueur de la colonne. Pas de vidange ou de défaillance imprévisible et prématurée.
  • Mauvaise mise à l'échelle : Même lorsque les colonnes préparatives utilisent les mêmes particules et la même chimie que les colonnes analytiques, une bonne mise à l'échelle n'est pas nécessairement assurée en raison des différences de densité du lit. Les colonnes préparatives OBD de Waters sont conçues de telle sorte que les densités de lit à l'échelle préparative correspondent aux densités de lit à l'échelle analytique. Grâce à une gamme de particules évolutives, nous pouvons vous aider à garantir une mise à l'échelle correcte de votre méthode dès la première fois, à chaque fois.
  • Irreproductibilité et approvisionnement : Waters possède l'ensemble de la chaîne d'approvisionnement et de fabrication après les matières premières de nos principales colonnes. Cela permet un contrôle de qualité robuste sur l'ensemble du processus de fabrication des colonnes.
    • Nous produisons fréquemment de petits lots de supports à partir de matières premières.
    • Nous concevons, usinons et assemblons nos propres colonnes.
    • Nous emballons nos propres colonnes

Cela réduit également notre risque de perturbations imprévues de la chaîne d'approvisionnement. Et si ces perturbations devaient se produire, cela nous permet d'ajuster rapidement les stocks. En tant que partenaire, lorsque nous réduisons nos risques en matière d'approvisionnement et de qualité, vous en faites autant. Pouvons-nous garantir un stock ou une rotation rapide de toute colonne, à tout moment ? Non, bien sûr. Mais sommes-nous prêts à atténuer les risques liés à la chaîne d'approvisionnement pour vous ? Je pense que oui.

Nous nous efforçons de vous fournir un produit disponible en permanence, de la plus haute qualité et performance, lorsque le besoin est le plus urgent.

Inscrivez-vous dès maintenant à notre webinaire COVID-19 Spotlight Series (10 h ET, 31 mars 2021) - Martin Gilar explorera la chromatographie en phase inverse par paire d'ions pour les oligonucléotides, y compris la purification des sondes PCR.

 

 

Informations et ressources supplémentaires :

Vous avez une idée, une question ou une proposition de collaboration ? Nous voulons vous entendre ! Si vous ne connaissez pas encore vos contacts locaux de Waters, contactez l'équipe de réponse à l'innovation de COVID pour une demande scientifique ou pour proposer une collaboration.