Outils analytiques pour le développement de biosimilaires : Partie 3, Glycosylation, Agrégation, et Variantes de charge

Les progrès de l'analyse à haute résolution pour la caractérisation des produits thérapeutiques innovants et biosimilaires

Biosimilaire de l'infliximab : Une comparaison analytique des variantes de glycosylation, d'agrégation et de charge

Dans l'étude de comparabilité biosimilaire suivante de l'infliximab réalisée par des scientifiques de Waters, trois lots d'infliximab innovant (produit dans la lignée cellulaire murine SP2/0) et trois lots d'un infliximab biosimilaire candidat (dérivé de cellules CHO) ont été comparés à l'aide de la solution de plateforme biopharmaceutique de Waters avec UNIFI.

Les échantillons ont été analysés pour la fraction de glycanes libérés, ainsi que pour les profils d'agrégation et de variation de charge. Dans la plupart des flux de travail, chacun des six échantillons a été analysé en trois exemplaires pour établir la reproductibilité analytique de base.

La confirmation de la structure primaire (c'est-à-dire la séquence) est fondamentale pour établir la biosimilarité avec un produit innovant. Cette question peut être abordée indirectement au niveau de l'analyse de masse des anticorps intacts et des études d'analyse de masse des sous-unités d'anticorps, mais elle nécessite des études de cartographie peptidique à haute couverture pour démontrer l'ordre linéaire des acides aminés dans les chaînes de protéines. Ces analyses servent également à définir la variation du produit pour des attributs tels que la glycosylation, le traitement terminal et d'autres modifications des protéines.

Dans cette série en trois parties, nous examinons comment les technologies analytiques UPLC et QTof-MS, qui ont été spécialement conçues pour la caractérisation biopharmaceutique, se combinent avec les logiciels et l'informatique pour faciliter le développement des biosimilaires à trois niveaux :

• Analyse des protéines intactes et des sous-unités
• Cartographie peptidique, réduite et non-réduite
• Analyse de la glycosylation, de l'agrégation et des variantes de charge

Analyse de la glycosylation

Dans tous les anticorps et de nombreux produits biothérapeutiques commercialisés, l'état de glycosylation a un effet direct et prononcé sur la structure, la stabilité, la demi-vie sérique, l'immunogénéité et la bioactivité de la molécule, et constitue un attribut de qualité critique (AQC).

La caractérisation et la comparaison du profil de glycosylation de l'infliximab ont commencé par l'examen des profils de glycosylation à partir des données de masse des sous-unités intactes et réduites. Grâce à ces analyses, il est apparu clairement que l'innovateur et le biosimilaire candidat partageaient de nombreuses glycoformes communes, mais que des différences mesurables dans les niveaux de glycoformes entre les échantillons seraient attendues entre les produits. L'analyse au niveau du glycopeptide et du glycan libéré nous a permis d'aborder ces différences dans une analyse plus sensible et ciblée.

Les cartes peptidiques UPLC/MSE ont révélé que les échantillons d'infliximab innovateurs et biosimilaires étaient glycosylés sur le peptide tryptique à chaîne lourde T26. Dans la carte peptidique, nous pouvons suivre les abondances des glycoformes individuelles de ce peptide détectées comme peptides modifiés dans l'étude de cartographie. Dans une application de cette approche, nous avons montré que l'abondance de la glycoforme G1F variait entre trois lots de l'innovateur et du biosimilaire.

Le pourcentage de la glycoforme G1, calculé automatiquement par le logiciel UNIFI, a montré des niveaux d'infliximab biosimilaire d'environ 18 %, en dehors de la fourchette des lots innovants (environ 25 à 28 %) qui ont été testés. Comme on pouvait s'y attendre dans des études correctement réalisées, des tendances d'abondance similaires ont été observées pour la glycoforme G1F lors de l'examen des données de masse intacte de la sous-unité de la chaîne lourde.

Les courbes de tendance des glycopeptides ont été générées automatiquement dans le logiciel UNIFI pour mettre en évidence la glycovariation des glycopeptides T26 dans tous les lots et répliques testés. L'analyse des glycopeptides est utile en tant que résultat orthogonal au profilage de la masse intacte et à l'analyse des glycanes libérés (ci-dessous), mais elle peut être particulièrement importante lorsqu'un biothérapeutique contient plusieurs sites de glycosylation distincts.

Les glycanes liés à l'azote ont été libérés par voie enzymatique (PNGase F) des lots de l'innovateur et du biosimilaire candidat, ont été marqués avec un marqueur fluorescent 2-AB (FLR) et analysés par chromatographie liquide à interaction hydrophile (HILIC) couplée à une détection de fluorescence et de masse précise. La préparation et le nettoyage des échantillons ont été réalisés à l'aide d'un kit GlycoWorks de Waters, avec analyse par la solution d'application Glycan, qui comprend l'accès à la bibliothèque de glycanes GU de Waters; il s'agit d'une option disponible avec la plateforme biopharmaceutique de Waters avec UNIFI. Les données recueillies à partir du canal de détection FLR sont utilisées pour l'identification et la quantification des pics, et les données de masse précises sont utilisées pour confirmer les pics d'abord attribués par rétention. (Notre étude a été réalisée avant l'introduction de notre système de Kit RapiFluor-MS de GlycoWorks pour le marquage et la libération des N-glycanes, qui optimise ce processus).

Afin de produire des profils de glycanes facilement reproductibles au jour le jour et d'un instrument à l'autre, l'utilisation d'un temps de rétention normalisé/calibré fait partie de la méthodologie standard utilisée pour cette analyse.

La rétention des glycanes est calibrée à l'aide d'une échelle de dextrane marquée (poly-glucose) qui est exécutée entre les échantillons inconnus, générant un tracé de la longueur de l'échelle de glucose en fonction du temps de rétention. Le recalibrage des pics en valeurs de rétention GU ou en unités de glucose permet de surmonter de nombreuses sources courantes de variabilité expérimentale dans l'analyse des glycanes libérés, et permet des attributions de pics basées sur GU à partir d'une recherche de glycanes marqués 2AB dans la bibliothèque de glycanes GU de Waters. Le logiciel UNIFI a automatisé l'étalonnage des GU, l'attribution des pics à partir de la base de données GU, la confirmation de la masse de ces attributions et la quantification à partir du canal de données FLR.

Dans le cas de l'infliximab, il y avait des différences considérables entre l'innovateur et les produits biosimilaires en ce qui concerne la glycosylation. Cela n'était pas surprenant puisque l'infliximab de l'innovateur était exprimé à partir d'une lignée cellulaire de souris SP2/0, tandis que l'infliximab biosimilaire était exprimé à partir d'une lignée cellulaire CHO. 24 espèces de glycanes ont été identifiées dans l'échantillon de l'innovateur et 18 dans celui du biosimilaire. Cette plus grande variété de N-glycanes détectés dans l'innovateur était principalement due à la détection de deux classes de glycans contenant de l'acide sialique (NeuAc et NeuGc) par rapport aux seules formes NeuAc observées dans le candidat biosimilaire dérivé de CHO.

Un niveau constamment faible (~1%) d'espèces de 1,3 alpha-Galactose (potentiellement immunogènes) a également été détecté uniquement dans l'innovateur. La glycosylation représentait la différence structurelle primaire la plus claire entre l'innovateur et cet ensemble d'échantillons biosimilaires candidats, et exigerait probablement que le sponsor biosimilaire établisse que les différences observées n'ont pas d'impact négatif sur les profils d'efficacité, de stabilité et de sécurité établis par la société innovatrice.

Découvrez comment nous avons mis à jour la méthode et les données pour comparer l'innovateur et le biosimilaire de l'infliximab afin d'utiliser le label RapiFluor-MS ainsi que la bibliothèque de glycanes GU correspondante.

Analyse des agrégats

La structure d'ordre supérieur est un autre attribut critique des produits biothérapeutiques, y compris les agrégats qui sont impliqués dans l'amélioration de l'immunogénicité du produit et qui affectent négativement la sécurité et l'efficacité du produit (puissance, clairance). La chromatographie d'exclusion de taille (SEC) est couramment utilisée pour l'analyse des agrégats des AcM et autres produits biothérapeutiques.

Les chromatogrammes SEC superposés de l'innovateur et du biosimilaire candidat ont établi que les dimères sont présents à des niveaux plus élevés dans le biosimilaire candidat.

La comparaison automatisée des échantillons d'un lot à l'autre a montré que 4 à 6 % de la protéine était dimérisée dans les lots biosimilaires, soit un niveau presque 10 fois supérieur à celui du produit innovant. Il y avait également une variabilité considérable dans la teneur en dimères parmi les lots biosimilaires, ce qui suggère que des améliorations du processus en aval ou des ajustements de la formulation seraient probablement nécessaires pour réduire l'agrégat à des niveaux plus typiques d'un produit mAb commercialisé.

Analyse des variantes de charge

Les variantes de charge des protéines reflètent les modifications des acides aminés, la composition des glycanes et les variantes structurelles d'un produit biothérapeutique. La surveillance du profil des pics de variants acides et basiques flanquant les pics principaux du produit est couramment utilisée comme test d'identité, de qualité du produit et de stabilité du processus dans un biothérapeutique purifié. Un gradient de pH ainsi qu'un gradient de sel peuvent être utilisés pour obtenir une sélectivité de séparation optimale pour l'analyse des variantes de charge de l'infliximab. L'utilisation de la carboxypeptidease B pour éliminer la lysine C-terminale des chaînes lourdes peut simplifier le profil des variantes de charge, augmenter le signal pour les formes de faible abondance au-dessus des limites de détection, et permettre le suivi d'un plus grand nombre de variantes de charge dans l'analyse.

La solution de plateforme biopharmaceutique de Waters avec UNIFI prend en charge la technologie Auto-Blend Plus, qui automatise la génération de phases mobiles à partir de réservoirs de solutions mères concentrées simples de tampons, de sel et d'eau, ce qui simplifie la préparation des tampons et réduit le risque d'erreur humaine dans la préparation des tampons IEX. La méthode de gradient Auto-Blend Plus garantit que le pH et la force ionique souhaités sont délivrés de manière reproductible à la colonne IEX pour les séparations de variantes de charge. Les variantes de charge peuvent être résolues de manière optimale par l'application d'un gradient de sel, d'un gradient de pH ou d'une combinaison des deux. Auto-Blend Plus permet de rechercher les conditions idéales lors du développement de méthodes et simplifie l'exécution de ces méthodes une fois optimisées.

La chromatographie par échange d'ions (IEX) avec détection UV de l'infliximab intact et l'analyse LC/MS de l'infliximab intact déglycosylé ont été utilisées pour comparer la variation de la lysine dans les lots d'infliximab innovateurs et biosimilaires. Les données sur la variation de la lysine obtenues par IEX ont été bien corrélées avec les résultats des mAb intacts et les résultats de la masse de la chaîne lourde intacte. Ceci a été démontré à l'aide de l'exemple de la variante de lysine nulle du mAb.

Découvrez comment l'Auto-Blend Plus aide à préparer l'avenir du laboratoire de CQ biopharmaceutique en automatisant la distribution de la phase mobile, en améliorant la cohérence du pH dans les méthodes SEC ou pour le développement de méthodes IEX.

Résumé des études de caractérisation des biosimilaires

L'automatisation des techniques analytiques peut minimiser les erreurs dans l'exécution des méthodes ainsi qu'augmenter la productivité. Dans les études présentées ici, nous avons montré comment les technologies analytiques et les outils informatiques de Waters pour les biothérapies ont permis une caractérisation efficace de l'infliximab innovateur et du candidat biosimilaire. Le flux de travail a évalué la similarité de la structure primaire (séquence), des modifications post-traductionnelles (PTM), de la glycosylation, du schéma des liaisons disulfure, des niveaux d'agrégation et des profils des variantes de charge, le tout en utilisant la solution de plateforme biopharmaceutique avec UNIFI.

Les capacités du système d'information scientifique UNIFI, utilisé conjointement avec les technologies UPLC, de détection optique et de spectrométrie de masse de Waters, permettent aux chercheurs de générer facilement des données, d'automatiser le traitement et de communiquer efficacement les résultats dans toute l'organisation. Les développeurs de produits biothérapeutiques et biosimilaires peuvent ainsi rationaliser leurs processus, partager leurs méthodes et réduire le temps de mise sur le marché, ce qui garantit la rentabilité et l'accès des patients aux médicaments biothérapeutiques modernes.

Révision :

• Lisez notre introduction sur le développement des biosimilaires et notre point de vue analytique sur la façon de comparer les biosimilaires au niveau de la protéine intacte.
• Lisez notre chapitre sur la cartographie peptidique (réduite et non réduite) dans le développement des biosimilaires.

Lecture connexe :

• Téléchargez la note d'application : Combinaison de RapiFluor-MS et du système d'information scientifique UNIFI pour une solution totale de glycanes N-liés pour les comparaisons entre l'innovateur et le biosimilaire Infliximab.
• Télécharger un pdf de ce livre blanc
• Voir d'autres exemples d'applications de notre plateforme technologique de caractérisation biopharmaceutique
• À propos de la solution de plateforme biopharmaceutique avec UNIFI
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