Outils analytiques pour le développement des biosimilaires : Partie 2, Analyse des peptides

Les progrès de l'analyse à haute résolution pour la caractérisation des produits thérapeutiques innovants et biosimilaires

Biosimilaire de l'infliximab : Une comparaison analytique au niveau des peptides

Dans l'étude de comparabilité biosimilaire suivante de l'infliximab réalisée par des scientifiques de Waters, trois lots d'infliximab innovant (produit dans la lignée cellulaire murine SP2/0) et trois lots d'un infliximab biosimilaire candidat (dérivé de cellules CHO) ont été comparés à l'aide de la solution de plateforme biopharmaceutique de Waters avec UNIFI.

Les échantillons ont été analysés au niveau de la protéine intacte, des sous-unités protéiques, de la digestion des protéines, de la fraction de glycanes libérés, ainsi que pour les profils d'agrégation et de variantes de charge. Dans la plupart des flux de travail, chacun des six échantillons a été analysé en trois exemplaires pour établir la reproductibilité analytique de base.

La confirmation de la structure primaire (c'est-à-dire la séquence) est fondamentale pour établir la biosimilarité avec un produit innovant. Cette question peut être abordée indirectement au niveau de l'analyse de masse des anticorps intacts et des études d'analyse de masse des sous-unités d'anticorps, mais elle nécessite des études de cartographie peptidique à haute couverture pour démontrer l'ordre linéaire des acides aminés dans les chaînes de protéines. Ces analyses servent également à définir la variation du produit pour des attributs tels que la glycosylation, le traitement terminal et d'autres modifications des protéines.

Dans cette série en trois parties, nous allons examiner comment les technologies analytiques LC et MS se combinent avec les logiciels et l'informatique pour faciliter le développement des biosimilaires à trois niveaux :

• Analyse des protéines intactes et des sous-unités
• Cartographie peptidique, réduite et non-réduite
• Analyse de la glycosylation, des agrégats et des variantes de charge

Cartographie réduite des peptides

La confirmation de la structure primaire (séquence) est essentielle pour vérifier la candidature réelle d'un biosimilaire potentiel. Une méthodologie standard pour la confirmation de la structure primaire des IgG est la cartographie peptidique UPLC/MSE sur un échantillon réduit en disulfure. Les cartes peptidiques UPLC/MSE réduites peuvent aider à mettre en évidence et à identifier les différences entre les séquences protéiques et les variantes de modification entre le candidat biosimilaire et l'innovateur. MSE est une technique d'acquisition MS indépendante des données où les profils MS quantitatifs et les données de fragmentation MS sont acquis sur tous les peptides dans une analyse de cartographie peptidique.

Les échantillons de cartographie peptidique réduits au disulfure (dithiothreitol) ont été alkylés et analysés par UPLC/MSE pour répondre aux exigences de l'établissement de la comparabilité des séquences protéiques avec l'innovateur, et pour identifier les variantes peptidiques modifiées et déterminer leur abondance relative.

Toutes les expériences de cartographie peptidique ont été réalisées sur une colonne ACQUITY UPLC Peptide BEH C18, 1,7-μm, 2,1 x 150 mm sur la même configuration d'instrument Biopharmaceutical Platform Solution avec UNIFI (UPLC avec QTof MS) que celle utilisée pour l'analyse de la masse intacte. Les données ont été acquises, traitées et rapportées automatiquement à l'aide du système d'information scientifique UNIFI. Une couverture protéique élevée équivalente a été obtenue pour les chaînes légères et lourdes de l'innovateur et du biosimilaire. Le support de fragmentation MSE a permis des attributions de haute confiance, et l'analyse a confirmé la séquence des peptides terminaux dans les échantillons d'infliximab biosimilaire et innovateur.

Alors que l'analyse basée sur la trypsine a établi la comparabilité au niveau des peptides, les exigences réglementaires sont d'établir la comparabilité pour la séquence absolue des acides aminés dans les produits innovateurs et biosimilaires, en excluant les modifications de traitement communes telles que le Lys C-terminal sur les chaînes lourdes. La réalité de cette exigence est que des études de cartographie plus approfondies, utilisant généralement d'autres enzymes de digestion complémentaires, sont nécessaires pour confirmer la fragmentation à chaque liaison peptidique dans la protéine à un niveau de certitude acceptable.

Un défi typique rencontré dans la cartographie peptidique et l'exercice de comparabilité des biosimilaires est la détection, le suivi et la comparaison quantitative des modifications peptidiques sur l'innovateur et le biosimilaire candidat. Dans un exemple, le peptide HC T24 contient une séquence xxxDGxxx "hot spot" avec un potentiel élevé d'isomérisation de l'Asp, où l'acide aspartique est converti de manière non enzymatique en acide isoaspartique. L'isoaspartique peut potentiellement être immunogène, peut affecter l'activité biologique et peut altérer la pharmacocinétique des médicaments thérapeutiques à base de peptides et de protéines. Ce produit d'isomérisation sera typiquement résolu à partir du peptide non modifié dans des conditions de cartographie UPLC, et le peptide modifié possédera une masse commune avec la forme non modifiée.

Les résultats traités ont montré que le peptide T24 de l'infliximab innovateur contenait environ 0,2 % de la variante IsoAsp, alors que le biosimilaire candidat contenait la variante à des niveaux de 0,1 %. Cette capacité de détecter, d'identifier et de quantifier de manière fiable de faibles niveaux de formes peptidiques variantes est essentielle pour justifier la confiance dans la biosimilarité.

Cartographie des peptides non réduits

La structure des protéines détermine la fonction, et il est important d'établir que la structure d'ordre supérieur, ou 3D, est conservée dans l'exercice de biosimilarité. Cela comprend non seulement un certain nombre d'études physicochimiques (CD, HDX, RMN, AUC...) qui ne sont pas abordées ici, mais aussi une extension de l'exercice de structure primaire : la détermination des modèles de liaison disulfure Cys-Cys. La formation de liaisons disulfure joue un rôle critique dans la stabilisation de la structure repliée en 3D et le maintien de l'activité biologique des protéines thérapeutiques.

Le brouillage des disulfures (mispairing) peut se produire soit pendant la production de protéines thérapeutiques, soit pendant les étapes de traitement en aval, soit lorsque les échantillons biothérapeutiques purifiés sont exposés à un stress environnemental. La rupture et le brouillage des disulfures peuvent se manifester par un mauvais repliement des protéines et une agrégation des produits. Il est donc crucial de confirmer la présence des liaisons disulfures attendues et de prouver l'absence de disulfures brouillés dans les protéines thérapeutiques, afin de garantir la qualité des médicaments et de satisfaire les autorités réglementaires.

La connectivité des liaisons disulfure, ou schéma de liaison, est généralement déterminée par la cartographie peptidique non réduite. L'infliximab contient 16 liaisons S-S (12 intra-chaîne et 4 inter-chaîne) avec la symétrie moléculaire d'une molécule d'IgG1 générant huit peptides uniques à liaison disulfure attendus dans la carte non réduite. Les échantillons d'infliximab ont été dénaturés, alkylés et digérés avec de la trypsine pour générer des digests non réduits pour l'analyse UPLC/MSE.

Le logiciel UNIFI a été utilisé pour automatiser l'acquisition, le traitement et le rapport des données UPLC/MSE de la carte peptidique non réduite de l'infliximab biosimilaire candidat. Une fonction de filtrage des données, disponible dans les éléments d'examen et de rapport des données du logiciel UNIFI, permet une vue personnalisée des données, en limitant l'affichage des données aux seuls peptides contenant des disulfures.

Avec ce filtre appliqué aux données, les huit peptides à liaison disulfure attendus ont été confirmés dans des lots d'échantillons d'innovateurs et de biosimilaires, tous avec confirmation par les ions de fragment de l'acquisition UPLC/MSE. Une recherche ultérieure de disulfures brouillés, avec une digestion in-silico plus limitée et des critères de recherche de modification variable pour limiter les exigences de la recherche combinatoire, n'a pas détecté de preuve de disulfures brouillés dans l'innovateur ou le biosimilaire candidat.

Voir la méthode et les données de notre étude automatisée de cartographie des liaisons disulfures comparant l'innovateur et le biosimilaire de l'infliximab.

Suivant : Analyse de la glycosylation, de l'agrégation et des variantes de charge

• Lisez notre introduction sur le développement des biosimilaires et notre point de vue analytique sur la façon de comparer les biosimilaires au niveau de la protéine intacte.
• Notre troisième partie de cette série sur les biosimilaires passe en revue la glycosylation, l'agrégation et l'analyse des variantes de charge.

Lecture connexe :

• Téléchargez la note d'application : Automated Disulfide Bond Mapping and Comparing Innovator and Biosimilar mAbs Using UNIFI Software (cartographie automatisée des liaisons disulfures et comparaison des anticorps innovants et biosimilaires).
• Télécharger un pdf de ce livre blanc
• Voir d'autres exemples d'applications de notre plateforme technologique de caractérisation biopharmaceutique
• À propos de la solution de plateforme biopharmaceutique avec UNIFI
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