Un point d'inflexion pour l'analyse des protéines des cellules hôtes biopharmaceutiques

La LC-MS est-elle devenue un outil généralement accepté pour compléter l'analyse HCP basée sur les immuno-essais ?

Mon collègue Catalin Doneanu et moi-même venons de rentrer de Lisbonne, au Portugal, où nous avons participé à la conférence du BEBPA sur l'analyse des protéines des cellules hôtes (HCP). Avec les 120 autres participants, nous avons pris part à des discussions ouvertes et réfléchies sur les meilleures pratiques pour l'analyse des protéines de cellules hôtes à l'aide de technologies immunologiques/ELISA conventionnelles. De plus, nous avons discuté de l'utilisation de technologies complémentaires - principalement les méthodologies LC-MS - pour valider et étendre les résultats de ces approches plus traditionnelles de l'analyse et du contrôle des protéines de cellules hôtes.

Quelques éléments me sont apparus comme des indicateurs clés de la direction que prend l'industrie biopharmaceutique dans ce domaine d'analyse difficile.

La confiance dans les gels 2D et le Western blotting en tant qu'outils précis de validation des tests HCP diminue.

Lors de la réunion, des discussions et des présentations ont permis d'exprimer la crainte que les méthodes courantes de validation des immunoréactifs utilisés dans l'analyse des protéines des cellules hôtes ne soient insuffisantes pour cette tâche.

En particulier, plusieurs intervenants ont exprimé leur méfiance à l'égard des gels 2D et du Western blotting en tant qu'outils permettant de démontrer la couverture des HCP dans des échantillons complexes, et d'établir que ces réactifs ont la large spécificité nécessaire pour établir un profil quantitatif des HCP. Des problèmes tels que la faible spécificité, la gamme dynamique limitée et la reconnaissance des épitopes linéaires par rapport aux épitopes 3D ont été cités parmi les raisons. Mais le problème le plus fondamental semble encore être que de nombreuses protéines ne sont pas reconnues par les systèmes immunitaires des animaux, qui génèrent les sérums polyclonaux utilisés comme réactifs dans ces tests.

L'industrie semble croire qu'avec beaucoup de temps, d'efforts et de coûts, elle peut créer des immunoréactifs raisonnables pour les quelques HCP restant à des niveaux significatifs dans le produit final. Cependant, ils doivent relever le défi de créer des tests qui permettent aux groupes de science des procédés d'obtenir un retour d'information rapide pendant le développement du procédé, et de soutenir les études de QbD en amont et en aval du procédé.

Dans plusieurs présentations, il a été suggéré que l'utilisation de flux de travail de type protéomique pour étudier les fractions purifiées par affinité avant et après la purification pourrait permettre de mieux comprendre quelles protéines sont reconnues par leurs réactifs. En outre, cette approche permettrait d'utiliser des flux d'analyse indépendants des données, comme la quantification LC-MSE et Top3. Ces flux de travail génèrent un aperçu plus quantitatif de la composition en HCP du surnageant de culture cellulaire et des étapes de purification en aval de leurs produits.

Jusqu'où devons-nous descendre ?

Les HCP de faible niveau peuvent avoir un impact sur la qualité du produit. Les discussions sur les enzymes phospholipases et protéases dont on a constaté qu'elles se copient avec les protéines biothérapeutiques ont renforcé la position selon laquelle même les HCP de faible niveau peuvent avoir des répercussions importantes sur la qualité des produits.

Un exposé d'Eli Lilly a indiqué qu'une phospholipase dopée à des niveaux de ppm à un chiffre pouvait dégrader rapidement les polysorbates à faible teneur utilisés dans les formulations biothérapeutiques - augmentant ainsi le risque d'instabilité du produit et générant des risques pour l'efficacité et la sécurité. Cela souligne une fois de plus la nécessité d'aller au-delà d'un résultat ELISA quantitatif et de connaître l'identité et l'abondance de vos HCP afin de minimiser les risques.

À l'horizon : l'identification des professionnels de la santé pour les vaccins

Les HCP sont également une préoccupation importante dans les produits vaccinaux - en particulier, la classe de vaccins sous-unitaires qui se développe le plus rapidement et qui sont produits et purifiés comme les protéines recombinantes thérapeutiques "bien caractérisées". L'immunogénicité (souhaitable dans un vaccin !) n'est pas la seule préoccupation concernant les HCP. Lors de l'examen des demandes, les organismes de réglementation ont apparemment demandé des données d'identification des HCP pour les produits vaccinaux.

La LC-MS est-elle la bonne réponse aux défis que posent aujourd'hui les protéines des cellules hôtes ?

Quelle est la place du LC-MS aujourd'hui, et quelles sont les attentes pour l'avenir ? Le grand changement que j'ai constaté lors de cette réunion est que seule une poignée de participants a contesté la nécessité des technologies LC-MS pour compléter les tests immunologiques/ELISA traditionnels et les approches de vérification sur gel. À l'autre bout du spectre, seuls quelques participants ont affirmé que la SM peut actuellement remplacer les tests immunologiques comme tests de libération utilisés pour la spécification des produits, ou comme seule technologie requise pour démontrer la validation de l'autorisation HCP dans un dossier réglementaire.

De manière générale, le consensus semble favoriser l'adoption d'approches basées sur la LC-MS pour compléter les tests génériques ou de plateforme HCP dans le développement de produits. Cela s'explique en grande partie par leur capacité à identifier et à quantifier les HCP qui peuvent être éliminés par des améliorations du processus, et par leur fiabilité en tant qu'outil de validation des réactifs immunitaires utilisés dans les essais d'élimination des HCP spécifiques au processus d'une substance médicamenteuse.

Poster : Reproductibilité du test HCP et comparabilité HCP d'un biosimilaire

Lors de la réunion, Catalin et moi avons présenté un poster sur l'analyse multi-laboratoire des HCP du mAb de référence du NIST et une étude de comparabilité des HCP innovateur/biosimilaire. La présentation a démontré que plusieurs laboratoires peuvent obtenir une liste reproductible d'impuretés HCP et leurs abondances à partir d'échantillons purifiés de mAb.

En outre, les travaux ont montré qu'il est possible pour deux entreprises ayant des processus de production de mAb uniques de produire un mAb biothérapeutique commun contenant un ensemble commun de HCPs, bien que présents à des niveaux différents.

Nous avons également lancé une nouvelle ressource - appelée HCP Toolbox - qui a été demandée par des chercheurs lors de réunions précédentes qui ont vu un outil similaire de Waters pour l'analyse HDX-MS. La boîte à outils fournit une présentation avec des notes de l'orateur, et un accès à la littérature clé qui aidera les chercheurs à discuter de la valeur de la LC-MS pour l'analyse HCP biopharmaceutique. La boîte à outils est accessible à l'adresse waters.com/HCPToolBox.

Une semaine formidable à Lisbonne

Dans l'ensemble, ce fut un plaisir de visiter Lisbonne pendant une semaine ensoleillée du mois de mai et de participer à cette conférence ciblée, où des discussions honnêtes et ouvertes sur les défis et les stratégies de contrôle et de surveillance des protéines des cellules hôtes ont imprégné les sessions du programme officiel et pendant les pauses et les événements sociaux. La réunion de l'année prochaine à San Francisco devrait poursuivre ces grandes discussions, et je me réjouis d'y participer à nouveau avec mes collègues de Waters.