Le mystère de la perte d'échantillons

Il y a plusieurs années, j'ai été embauché par une société biopharmaceutique pour développer des méthodes analytiques pour les oligonucléotides thérapeutiques. Lorsqu'un nouveau collègue m'a mis en garde contre la perte d'échantillons sur les colonnes LC, je l'ai regardé avec scepticisme. "Oui", a-t-il insisté, "une partie de votre échantillon d'ADN peut être liée de manière irréversible à la colonne et vous ne la reverrez plus jamais !". J'avoue que je pensais que c'était une idée originale. Après tout, ce qui monte, doit redescendre. Ce qui est injecté sur une colonne doit être élué. N'est-ce pas ?

Faux.

Au fur et à mesure que j'ai acquis de l'expérience avec les oligonucléotides, j'ai appris que les premières injections d'acides nucléiques sur une nouvelle colonne présentaient une perte d'échantillon appréciable et une queue de pic caractéristique. Il fallait toujours plusieurs injections pour que ce problème disparaisse et pour obtenir une "passivation" de la colonne.

Des années plus tard, j'ai rencontré un problème similaire avec les phosphopeptides. Cette fois, ma tâche consistait à analyser par LC-MS de petites quantités de protéines digérées. Je me suis rapidement rendu compte que les peptides monophosphorylés s'éluaient très bien de la colonne, alors que les peptides doublement phosphorylés présentaient une queue désagréable, et que les espèces triplement phosphorylées s'éluaient sous la forme d'une bosse sur ma ligne de base, que je ne peux identifier que grâce à mon spectromètre de masse. Les phosphopeptides comportant quatre espèces phosphorylées ou plus ne me donnaient pas de pics reconnaissables et étaient impossibles à quantifier, à moins de recourir à quelques astuces créatives (par exemple, pH basique de la phase mobile ou EDTA dans l'échantillon). J'ai réalisé que l'adsorption non spécifique des échantillons sur le matériel LC est beaucoup plus courante que je ne le pensais.

De nombreux utilisateurs n'ont jamais rencontré le problème de la perte d'échantillon due aux surfaces métalliques des colonnes LC. Comme moi, ils pratiquent surtout l'analyse de petites molécules neutres, qui se comportent bien sur le plan chromatographique. Même les chimistes analytiques expérimentés ont tendance à sous-estimer le problème des composés qui "collent" aux surfaces d'oxyde métallique. Ils peuvent même penser qu'il s'agit d'une idée farfelue.

Eh bien, ceux qui analysent les glycanes sialylés, les acides organiques tricarboxyliques, les phosphopeptides ou, en gros, tout analyte acide, le savent mieux que quiconque. J'encourage tous les scientifiques analytiques à suivre cette nouvelle série de blogs. Mes collègues et moi y discuterons de la solution à ce défi analytique commun. Il existe plusieurs astuces et améliorations passionnantes de la technologie LC que vous voudrez peut-être découvrir. Continuez donc à lire, cela vous fera gagner du temps et vous évitera des ennuis dans vos futurs projets analytiques !