5 défis de préparation d'échantillons pour la bioanalyse des peptides (et comment les surmonter !)

Kim Haynes

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Temps de lecture : 3 minutes

Les scientifiques qui ont travaillé avec des peptides savent que la quantification des peptides peut être un défi. L'une des clés d'une analyse peptidique réussie est la préparation minutieuse et sélective des échantillons.

La préparation des échantillons améliore divers aspects des analyses par chromatographie et spectrométrie de masse en utilisant l'extraction en phase solide (EPS) pour séparer chimiquement les différents analytes et aider à éliminer les composants de la matrice interférant dans un échantillon.

Nous aborderons ici cinq des principaux défis de la préparation d'échantillons de peptides, notamment :

  • Liaison des protéines
  • Liaison non spécifique (NSB)
  • Solubilité des peptides
  • Spécificité du peptide
  • Récupération

Liaison aux protéines
Dans le cas de l'analyse des peptides, une préparation minutieuse de l'échantillon peut aider à traiter à la fois la liaison aux protéines et la liaison non spécifique. Une façon d'éliminer la liaison du peptide aux protéines (ou à d'autres composants de la matrice) pendant la préparation de votre échantillon est de diluer le plasma 1:1 avec du H3PO4 à 4% ou du NH4OH à 5%. En fonction de la force de la liaison de vos peptides aux protéines, vous devrez peut-être prendre des mesures plus agressives comme la dénaturation avec de la Guanidine HCl, de l'urée ou du SDS, ou même une PPT de rapport 1:1 avec de l'ACN.

Liaison non spécifique
Afin de résoudre le problème de la liaison non spécifique (NSB), il est important de tenir compte du contenant de l'échantillon lors de la préparation de celui-ci. Les peptides sont notoirement collants et peuvent adhérer au verre. Plutôt que d'utiliser du verre pour la préparation des échantillons, essayez le polypropylène ou des matériaux conçu avec des surfaces de haute performance pour une faible liaison des peptides et des protéines. Cela permettra de réduire les problèmes de liaison non spécifique.

De plus, les peptides peuvent être perdus pendant les étapes de séchage et de reconstitution de la préparation de l'échantillon en raison de l'adsorption sur le récipient de collecte ou de l'échec de la re-solubilisation. Ces pertes peuvent être réduites en utilisant un format de µElution. L'utilisation d'un produit tel qu'une plaque de µElution vous permet d'éviter l'évaporation et élimine le besoin de reconstitution puisque le volume d'élution n'est généralement que de 25-50 microlitres. Il suffit de diluer l'éluat 1:1 avec de l'eau et de l'injecter.

Solubilité des peptides
Afin d'éviter la précipitation de vos peptides, il est suggéré de limiter la concentration organique à un maximum de 75 %. Vous pouvez également utiliser des modificateurs pour favoriser la solubilité, mais cela peut nécessiter des concentrations plus élevées que celles que vous avez utilisées avec les petites molécules. Essayez une gamme allant de 1% à 10% d'acide ou de base, comme le TFA, FA, AA ou NH4OH.

Spécificité des peptides
La quantification des peptides nécessite des méthodes très sensibles et reproductibles. Dans de nombreux cas, la précipitation des protéines, très populaire pour la bioanalyse des petites molécules, ne sera pas assez propre pour les méthodes sensibles de détection des peptides. La spécificité est obtenue en créant une méthode de préparation des échantillons qui utilise des approches de nettoyage orthogonales, à la fois en phase inverse et par échange d'ions, pour capturer sélectivement votre peptide cible, tout en vous permettant d'éliminer par lavage les interférences indésirables de la matrice. Concentrez ensuite votre peptide dans un petit volume d'élution qui peut être dilué avec un peu d'eau et directement injecté dans le système LC-MS.

Récupération
Des récupérations faibles ou variables sont généralement des symptômes de l'un des quatre problèmes décrits ci-dessus. Lorsque vous constatez de faibles taux de récupération, revoyez les mesures que vous pouvez prendre pour réduire la liaison aux protéines, la liaison non spécifique, la solubilité des peptides et augmenter la spécificité des peptides dans votre protocole de nettoyage des échantillons. L'une ou l'autre de ces mesures peut être la clé de l'amélioration de votre méthode de bioanalyse des peptides.

Informations supplémentaires sur les peptides et la préparation des échantillons

Regardez l'épisode 2 :