5 idées : Quantification des protéines à l'aide de la méthode des peptides de substitution
Bioanalyse des produits biologiques
Sur quoi pouvez-vous mettre d'accord tous les grands scientifiques de l'industrie pharmaceutique et des sociétés de recherche sous contrat ? Que l'industrie biopharmaceutique est en pleine croissance et que la quantification des protéines pour la bioanalyse est difficile - mais vous avez des options. Les informations suivantes vous permettront de faire le point sur les défis, les problèmes et les solutions actuels.
1. La biopharmacie connaît une croissance rapide
Le développement de médicaments biopharmaceutiques connaît une croissance rapide. Plus de 600 produits biologiques ont été approuvés par la FDA américaine et plus de 50 anticorps monoclonaux (AcM) ont été approuvés aux États-Unis et dans l'UE [1], et au moins 300 autres AcM sont en cours de développement [2]. Cette croissance oblige les scientifiques à s'attaquer à une variété de défis qui ne sont pas présents dans la quantification des petites molécules(comme celles-ci).
2. Les approches bioanalytiques actuelles ont des limites
La quantification des protéines implique des flux de travail complexes et longs, ainsi qu'un développement ardu des méthodes. Les essais de liaison de ligands (LBA) ont traditionnellement été utilisés pour la quantification en raison de leur grande sensibilité, de leur faible coût et de leur débit élevé. Malgré ces avantages, les LBA ont une gamme dynamique linéaire limitée, présentent un risque de réactivité croisée entre les métabolites/analogues et sont difficiles à multiplexer. De plus, si un nouvel anticorps LBA est nécessaire pour votre protéine d'intérêt, le temps et le coût de développement sont importants.
3. La LC-MS offre des avantages
La chromatographie et la spectrométrie de masse (LC-MS) sont apparues comme une approche très efficace pour la bioanalyse des protéines, notamment pour la découverte de médicaments, le développement précoce et les études précliniques. La LC-MS présente un certain nombre d'avantages par rapport aux LBA, notamment une spécificité et une précision accrues, le multiplexage (possibilité de détecter plusieurs protéines en un seul passage), une gamme dynamique linéaire plus large, un développement plus rapide de la méthode (souvent de quelques jours à quelques semaines) et l'absence de nécessité de développer des anticorps spécifiques aux protéines.
La quantification des protéines par LC-MS offre une variété d'options, chacune présentant des avantages et des inconvénients. Si l'on prend l'exemple des AcM, il existe deux flux de travail principaux dans la boîte à outils : Les analyses intactes et digérées. Les avantages de chacune dépendent des exigences et des restrictions particulières de chaque scientifique. Bien que ce blog soit axé sur l'approche des peptides de substitution, il convient de mentionner que l'analyse des AcM intacts est possible (même au niveau de 1 ng).
Pour l'analyse des anticorps intacts par LC-MS, un spectromètre de masse à haute résolution (HRMS) comme le QTof MS est idéal car il offre la plus large gamme de masse (>150 Kd) et une très haute résolution. Les AcM intacts peuvent être difficiles à ioniser parce qu'ils ont des enveloppes très chargées, qu'ils attirent les ions de sel et qu'ils sont fortement glycosylés, ce qui nécessite une préparation importante de l'échantillon.
Les instruments HRMS permettent également d'effectuer des analyses qualitatives et d'utiliser la mobilité ionique comme étape de séparation supplémentaire. Pour en savoir plus sur les avantages de la mobilité ionique, consultez ce récent article de blog du Dr Nigel Ewing.
4. L'approche des peptides de substitution
L'approche des peptides de substitution est devenue la stratégie la plus couramment utilisée pour la quantification des protéines par spectrométrie de masse en raison de sa sensibilité et de sa spécificité élevées et de la grande disponibilité des spectromètres de masse à triple quadripôle (TQ) dans les laboratoires de bioanalyse [3].
Dans cette approche, la protéine cible est digérée en peptides plus petits. Ensuite, un ou plusieurs peptides uniques présentant une bonne sélectivité et une bonne sensibilité sont utilisés comme mesure de substitution (ou substitut) de la protéine cible. Les peptides de substitution sont ensuite analysés par LC-MS.
La digestion est essentielle pour tirer parti des avantages de la spectrométrie de masse TQ, car le rapport masse/charge est de 2048 m/z et la gamme de masse totale est d'environ 6000 Da. Un mAb intact a une très grande masse, environ 150 kD, beaucoup trop grande pour une analyse intacte sur un TQ MS.
Enfin, en raison de leur utilisation prolifique et de leur grande sensibilité, les spectromètres de masse TQ sont considérés par les organismes de réglementation mondiaux comme l'étalon-or de la quantification et sont donc idéaux pour la méthode des peptides de substitution.
5. La préparation complexe des échantillons n'est pas un obstacle
Que l'on utilise la méthode LBA, l'analyse intacte ou la digestion, les flux de travail de quantification des protéines, y compris les exigences de préparation des échantillons, prennent intrinsèquement beaucoup de temps. L'approche des peptides de substitution ne fait pas exception. De multiples étapes et de multiples aspects au sein de chaque étape nécessitent une optimisation. En plus de la complexité du flux de travail et du manque de normalisation, la digestion reproductible et rapide des protéines reste un défi, en particulier pour les utilisateurs novices.
Pour résoudre ces problèmes, les scientifiques de Waters ont développé les kits de digestion ProteinWorks™. Avec cinq options, ces kits validés simplifient le flux de travail de la bioanalyse des protéines en regroupant les réactifs fiables, les outils d'extraction en phase solide par microélution, un module de collecte et des protocoles éprouvés dont les analystes ont besoin pour une préparation réussie des échantillons. Les kits et leurs protocoles sont conçus pour réduire les étapes et les variables du flux de travail tout en fournissant des résultats reproductibles, sensibles et précis.
Nos experts vous en diront plus
Erin Chambers, l'un des experts les plus connus de l'industrie en matière de bioanalyse des peptides et des protéines, a discuté des "Considérations pratiques pour la bioanalyse LC/MS des protéines via l'approche des peptides de substitution" lors d'une récente conférence industrielle. Écoutez son point de vue dans cette vidéo.
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Références :
- https://www.antibodysociety.org/news/approved_mabs.php
- https://www.bptc.com/sites/default/files/articles/ecker-2015-the_therapeutic_monoclonal_antibody_market-rprnt.pdf
- https://www.labome.com/method/Quantitative-Bioanalysis-of-Proteins-by-Mass-Spectrometry.html
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