Un caso de unión no específica (NSB)

Todos hemos pasado por eso. Pasas horas (a veces días) en el laboratorio preparando tus muestras. Las lleva cuidadosamente al automuestreador, carga con cariño la cola de muestras y pulsa el botón de reproducción. Por supuesto, las ejecutas durante la noche porque el tiempo del instrumento es precioso y alguien tiene que utilizarlo mañana. Llega al laboratorio por la mañana y se instala inmediatamente para procesar sus datos.

Y no hay nada allí.

¿Olvidó inyectarse? No. ¿Tal vez no te inyectaste el analito en absoluto? Estás empezando a cuestionar tu cordura.

"Entonces, ¿a dónde fue mi muestra?"

Si está seguro de no haber cometido los errores habituales (que todos cometemos), y sabe que su muestra debería estar ahí, pero no lo está, ¿a dónde ha ido a parar?

Los péptidos y las proteínas son especialmente propensos a la unión no específica (NSB) o a la adsorción a superficies sólidas. Estas superficies pueden ser puntas de pipeta, contenedores de almacenamiento de muestras o agujas de inyección. Ahora bien, todos conocemos formas de mitigar la adsorción, como:

• utilizando proteínas portadoras (que pueden añadir complejidad no deseada a nuestras muestras) o
• utilizar materiales de laboratorio con superficies de alto rendimiento para ayudar a evitar que se produzca la adsorción en primer lugar.

Sin embargo, en muchos casos, podemos optar por no abordar el problema.

¿Está preparado para afrontar las consecuencias de la unión inespecífica en su análisis de muestras?
Entre ellas se encuentran:

• Baja recuperación
• Alta variabilidad
• Poca sensibilidad
• Rango dinámico lineal insuficiente

Examinemos más a fondo estas consecuencias.

Baja recuperación

El desarrollo de métodos analíticos para péptidos puede ser un reto. Durante el desarrollo del método LC-MS, a menudo utilizamos muestras preparadas en solución pura para optimizar la cromatografía, identificar los fragmentos de la EM y estimar el rango dinámico lineal del ensayo. Sin embargo, esto puede ser problemático para los péptidos. Por ejemplo, el pramlintide (MW 3949,4 Da), un péptido grande e hidrofóbico, puede perderse por completo en la solución pura. Por si fuera poco, el grado de NSB observado no sólo depende del péptido, sino también de su concentración. Si no tomamos medidas para mitigar el NSB durante el desarrollo del método, podemos llegar al trabajo por la mañana y no ver ninguna señal del analito. O podemos estimar incorrectamente los posibles límites de detección de nuestro ensayo. Todo esto supone un tiempo extra en nuestro día que ninguno de nosotros puede permitirse perder.

Alta variabilidad

Si decidimos no combatir el NSB de alguna manera, ¿cómo podemos estar seguros de que nuestras réplicas de muestras se adsorben a la misma velocidad? ¿O en la misma cantidad? No podemos. Y esto puede conducir a una alta variabilidad. En este ejemplo, la recuperación de leuprolida (MW 1209,4 Da) en la solución pura fue sólo del 2%, lo que llevó a una variabilidad muy alta con un % CV de 41,8 (N=3). Por el contrario, la leuprolida preparada con una mitigación adecuada del NSB dio lugar a unos CV de área de pico del 1,7% (N=3). La alta variabilidad asociada a nuestras muestras de "solución pura" es inaceptable en cualquier ensayo bioanalítico. Los datos serían rechazados y los límites inferiores de cuantificación del ensayo serían más altos de lo deseado.

Poca sensibilidad

Con una baja recuperación y una alta variabilidad de nuestro analito a bajas concentraciones, el rango dinámico lineal de nuestro ensayo va a estar muy limitado. Cuando se desarrollan ensayos farmacocinéticos, es necesario poder cuantificar el analito en un amplio rango, y a niveles potencialmente muy bajos. Como los resultados de estos ensayos pueden guiar las decisiones clave en el desarrollo de fármacos, es fundamental que tengamos confianza en nuestros resultados de cuantificación. Por lo tanto, la contabilización adecuada del NSB puede ser la diferencia entre un ensayo exitoso y uno fallido.

La próxima vez que entre en el laboratorio y descubra que falta su analito, pregúntese lo siguiente:

"¿He hecho lo suficiente para combatir la unión inespecífica?"

Si no estás seguro, no dudes en pedir ayuda a nuestros científicos de Waters.

Esté atento a la próxima entrada de nuestro blog "Muestras perdidas en el contenedor: la unión no específica y el impacto de los agentes de bloqueo", por el doctor Moon Jung.

Recursos adicionales:

Campo de entrenamiento en bioanálisis de péptidos y proteínas