Aditivos de fase móvil para la caracterización de péptidos

La caracterización de péptidos y proteínas puede ser un reto debido a cuestiones como la adsorción, las distintas hidrofobicidades y la especificidad, por nombrar sólo algunas.

Cuando se analizan péptidos por Cromatografía Líquida (CL) y Espectrometría de Masas (EM), es beneficioso introducir aditivos en la fase móvil para facilitar la ionización y mejorar la señal del analito.

Además, estos aditivos (es decir, ácidos fuertes o tampones) se utilizan habitualmente en LC para mejorar la retentividad del analito y la forma del pico. Pero para las separaciones por EM, son necesarios aditivos de fase móvil de alta pureza para reducir la contribución de fondo y garantizar la calidad de los datos.

Los aditivos más comunes son el ácido trifluoroacético (TFA) para el análisis de LC y el ácido fórmico para el análisis de MS. Además de mejorar la señal del analito, los aditivos de la fase móvil, como el TFA, también se utilizan para inhibir las interacciones secundarias no deseadas en las aplicaciones de LC. Sin embargo, hay otra solución olvidada que también hay que tener en cuenta: El ácido difluoroacético (DFA).

Cada una de las opciones disponibles ofrece ventajas para determinadas técnicas, pero ¿dónde puede tener la selección de aditivos un impacto negativo en la aplicación?

Ácido trifluoroacético (TFA)

El TFA es generalmente el aditivo de fase móvil de elección en los casos en que se utiliza la detección UV debido a su gran solubilidad y poder de resolución como ácido fuerte. Por el contrario, el TFA proporciona resultados mediocres cuando se utiliza la detección por MS porque el TFA desprotonado forma pares de iones con los péptidos o analitos de interés, disminuyendo la abundancia del analito que llega al detector. Este fenómeno se conoce como supresión iónica. Además, el TFA es famoso por contaminar los sistemas de EM y ser casi imposible de eliminar. Es excelente para la detección UV, pero no para la detección MS.

Ácido fórmico (FA)

El ácido fórmico es el aditivo de fase móvil más utilizado en las separaciones por EM. Resulta excelente para las técnicas LC-MS de fase inversa, sin embargo, proporciona algunas injusticias para la detección UV. Por ejemplo, incluso cuando se utiliza FA de alta pureza, las líneas de base UV suelen ser más altas que las separaciones con TFA y la forma y simetría de los picos disminuye. No es bueno para la detección UV, pero sí para la detección MS.

Ácido difluoroacético (DFA)

El ácido difluoroacético (DFA) es un agente emparejador de iones que logra un equilibrio entre la forma del pico óptico y la respuesta de la EM deseada en los flujos de trabajo basados en LC-UV/MS de péptidos. Al ser un ácido más débil que el TFA, el DFA no suprime los iones ni contamina el sistema de EM. Pero al ser un ácido más fuerte que el AF, el DFA resolverá los picos y mejorará la simetría de la detección UV. Excelente para la detección UV, excelente para la detección MS.

Conclusión

Cuando se trata del análisis de péptidos, los aditivos de la fase móvil pueden mejorar significativamente el rendimiento. Sin embargo, es importante tener en cuenta qué técnica (LC, MS o ambas) se está utilizando y hacer la selección adecuada en función de esa técnica y de los requisitos de la aplicación.

Para los científicos centrados únicamente en el análisis de LC, el TFA puede ser la opción más adecuada. Para los que trabajan únicamente con MS, el FA puede ser el camino a seguir. Para los científicos que trabajan con ambas técnicas, un aditivo de fase móvil único, como el DFA, puede ser la elección correcta para usted.