Necesidad de un poco de alivio del ácido polar de fase invertida

La retención de analitos polares mediante condiciones cromatográficas de fase inversa (RP) ha frustrado a los científicos durante mucho tiempo. Intentar promover las interacciones entre los analitos polares y las superficies no polares de la fase inversa puede llevar al punto de ruptura al científico de separación más experimentado.

Los ácidos polares presentan específicamente su propio conjunto de desafíos que los hacen particularmente difíciles de retener en condiciones cromatográficas de fase inversa. Los silanoles ionizados presentes crean una carga negativa en la superficie de la fase estacionaria que repele los ácidos ionizados y cargados negativamente. Los científicos pueden utilizar algunas "soluciones" para retener los ácidos polares en una columna de fase inversa, pero éstas suelen añadir otra capa de complejidad y variabilidad potencial a sus flujos de trabajo. Aquí se enumeran algunas de las "soluciones" más comunes, junto con los problemas que conllevan:

El acero inoxidable, a menudo asociado a la columna analítica y que se encuentra en la ruta de flujo del sistema, presenta otro problema con el análisis de ácidos polares. Los grupos ácidos objetivo, los que contienen grupos funcionales fosfóricos, carboxílicos y/o sulfatos, pueden unirse a los iones metálicos en el recorrido del flujo. A menudo se añaden reactivos quelantes a la fase móvil para evitar/mitigar que estos analitos interactúen con los iones metálicos, pero al igual que los reactivos de emparejamiento de iones, estos aditivos a menudo no son adecuados para la espectrometría de masas.

¿Existe una solución mejor/fácil que pueda utilizarse para retener compuestos ácidos polares en condiciones de fase inversa? ¿Una solución que no añada pasos adicionales a mi flujo de trabajo?

La cromatografía de modo mixto o multimodal es una respuesta a esta cuestión. Estos tipos de fases estacionarias combinan múltiples modos de separación que pueden ser ajustados para separar analitos que tienen diferentes propiedades fisicoquímicas. La combinación de la fase inversa con el intercambio aniónico proporciona la solución necesaria para poder retener estos ácidos polares difíciles mientras se opera en condiciones de fase inversa.

Más del 50% de las moléculas de los fármacos utilizados en medicina existen como sales. Los fármacos suelen formarse como un ácido o una base débil, pero esta forma de fármaco no siempre es óptima para su disolución o absorción en el organismo. Sin absorción, un fármaco no puede tener un efecto terapéutico, por lo que algunas formas requieren una sal. Además, muchos medicamentos deben ser hidrosolubles. Por lo tanto, los fármacos a menudo se convierten químicamente en sus formas de sal para mejorar la disolución del fármaco, impulsar su absorción en el torrente sanguíneo y aumentar su eficacia. Las determinaciones precisas de los contraiones de los medicamentos son obligatorias para las pruebas de liberación y el control de calidad (CC) de todas las sales farmacéuticas, a fin de confirmar la identidad de la forma de la sal y el equilibrio de masas del ingrediente farmacéutico activo (API).

La Figura 1 muestra la retención y separación del fármaco antihistamínico Maleato de Clorfeniramina en una columna de fase inversa C18 que fue diseñada para retener analitos polares, y una columna de intercambio aniónico RP de modo mixto. La columna C18 retiene bien el analito básico hidrofóbico Clorfeniramina pero no puede retener el analito ácido polar Maleato. El maleato, un pequeño ácido polar, no se retiene en esta columna y eluye en el vacío. La columna de modo mixto RP/intercambio aniónico retiene bien ambos analitos. Incluso con un cambio en el orden de elución, la clorfeniramina es retenida a través de las interacciones RP, y el analito ácido polar Maleato es retenido por el intercambio aniónico.

Para hacer frente a las pérdidas de absorción de analitos ácidos en el acero inoxidable, era necesario inventar una nueva tecnología. Las superficies de alto rendimiento MaxPeak (HPS) se diseñaron para aumentar la recuperación de analitos, la sensibilidad y la reproducibilidad minimizando las interacciones analito/superficie. Esta tecnología resuelve los problemas que suelen surgir con los analitos ácidos que interactúan con el hardware de las columnas de acero inoxidable sin sacrificar las ventajas del acero inoxidable, una de las cuales es la capacidad de funcionar a presiones más altas.

El monofosfato de guanosina 5' es un nucleótido que se utiliza como monómero en el ARN. El grupo funcional monofosfato, rico en electrones, es atraído por la superficie de óxido metálico deficiente en electrones asociada al hardware de acero inoxidable. Las interacciones entre el grupo funcional fosfato y los iones metálicos provocan una pérdida de intensidad de la señal (área) y un aumento de la asimetría de los picos. La utilización de un hardware de columna que mitigue las interacciones analito/superficie para estos tipos de analitos ácidos, reduce significativamente las pérdidas de área y mejora la forma del pico de los analitos.

El reto de retener ácidos polares está a sólo una columna de modo mixto. Utilizar una fase estacionaria de intercambio aniónico/fase inversa para retener tanto los ácidos hidrofóbicos como los polares es una solución sencilla para lo que se consideraba una tarea frustrante. Las columnas que utilizan MaxPeak HPS proporcionan una ventaja adicional, ya que aumentan el área y mejoran la forma de los picos para estos compuestos ácidos al reducir significativamente las interacciones analito/superficie.

Para más información, consulte:

https://legacy-stage.waters.com/waters/library.htm?locale=en_US&lid=135042697

https://legacy-stage.waters.com/content/dam/waters/en/app-notes/2020/720006745/720006745-en.pdf

https://legacy-stage.waters.com/waters/library.htm?locale=en_US&lid=135042507