Cómo las tecnologías analíticas apoyan el desarrollo de medicamentos biosimilares

Scott Berger

Tiempo de lectura: 10 minutos

Avances en la analítica de alta resolución para la caracterización de terapias innovadoras y biosimilares

A medida que la industria farmacéutica sigue evolucionando desde los medicamentos de moléculas pequeñas hasta las carteras de productos equilibradas que incluyen las proteínas terapéuticas, los químicos analíticos se enfrentan cada vez más al reto de producir flujos de trabajo de caracterización rutinarios y automatizados que hagan avanzar los productos biofarmacéuticos innovadores y biosimilares a través del desarrollo y la comercialización.

Los fármacos bioterapéuticos, como los anticuerpos monoclonales (mAbs), son heterogéneos.

Introducción

Los productos bioterapéuticos son muy complejos y heterogéneos y difieren fundamentalmente de los fármacos de moléculas pequeñas sintéticas altamente purificadas: en tamaño, complejidad, en la forma de fabricarlos y en los datos necesarios para demostrar su similitud.

Un gran número de estos complejos productos bioterapéuticos, que son el resultado de años de investigación pionera y de complejos procesos de fabricación, están dejando de estar protegidos por patentes y, por lo tanto, están creando la difícil pero multimillonaria oportunidad de introducir versiones biosimilares de productos innovadores a medida que expiran más patentes de medicamentos biológicos.

Las proteínas bioterapéuticas se están convirtiendo en un segmento cada vez más importante de la industria farmacéutica, lo que exige que los científicos cuyas carreras analíticas se han invertido en los laboratorios farmacéuticos tradicionales de moléculas pequeñas se centren en la caracterización y el análisis de moléculas grandes.

Esto ha creado la demanda para que los proveedores de tecnología de cromatografía y espectrometría de masas diseñen instrumentación, software informático y flujos de trabajo que estén diseñados a propósito para apoyar los estudios de análisis de proteínas y que sean más accesibles y automatizados para la adquisición, el procesamiento y los informes de los estudios de caracterización y comparabilidad requeridos para las aprobaciones de innovadores y biosimilares.

En esta serie de tres partes, vamos a revisar cómo las tecnologías analíticas de LC y MS se combinan con el software y la informática para facilitar el desarrollo de biosimilares en tres niveles:

¿Qué es la biosimilitud?

Empecemos por lo básico. Dado que muchas características de los medicamentos bioterapéuticos son únicas y dependen de un proceso de fabricación específico, sólo se puede esperar que los productos biosimilares demuestren similitud con un producto bioterapéutico de referencia, en lugar de producir un patrón idéntico de variación del producto.

Las vías de aprobación reglamentaria existentes para los medicamentos genéricos de moléculas pequeñas no se aplican a la aprobación de los biosimilares, debido a su complejidad inherente. La similitud entre un biosimilar y su producto bioterapéutico de referencia debe evaluarse con respecto a la calidad, la seguridad y la eficacia.

De hecho, los reguladores se dan cuenta de que con los medicamentos biológicos, incluso lote a lote del mismo fabricante, no se producirá un producto idéntico. Por eso decimos que el producto de referencia es muy similar de un lote a otro, y se espera que el productor de biosimilares produzca algo dentro de ese rango de variación.

Según la sección 351 de la FDA de EE.UU., biosimilar significa "que el producto biológico es altamente similar al producto de referencia, a pesar de las pequeñas diferencias en los componentes clínicamente inactivos; y no hay diferencias clínicamente significativas entre el producto biológico y el producto de referencia en términos de seguridad, pureza y potencia del producto".

¿Qué significa esto para los químicos analíticos? Mientras que las diferencias serán detectables analíticamente entre los lotes de bioterapéuticos innovadores y biosimilares, un desarrollador de biosimilares tendrá que establecer que los atributos críticos del producto están dentro del rango del historial del producto innovador, o que aquellos cambios fuera del rango histórico no son clínicamente significativos para la seguridad, pureza o potencia.

La FDA reconoce la importancia de las tecnologías analíticas de LC y MS en la definición de estos atributos críticos de calidad. A finales de 2016, la FDA revisó el impacto de la tecnología LC y MS en un artículo de JASMS, "A Retrospective Evaluation of the Use of Mass Spectrometry in FDA Biologics License Applications".

En Europa, la EMA ha emitido directrices similares para los biosimilares, afirmando que "es necesario aplicar amplios estudios de caracterización del estado del arte al biosimilar y al medicamento de referencia (originario) en paralelo, para demostrar con un alto nivel de garantía que la calidad del biosimilar es comparable a la del medicamento de referencia".

Por lo tanto, sigue siendo responsabilidad del productor de biosimilares evaluar el alcance y la pertinencia de cualquier estudio de caracterización que deba realizar.

A medida que las expectativas normativas se definen mejor en los mercados desarrollados y aumenta la demanda en los mercados emergentes para acceder a bioterapias seguras y eficaces, las oportunidades son propicias para que los biosimilares logren un crecimiento acelerado del mercado, y las previsiones sugieren que el mercado mundial de biosimilares podría alcanzar los 35.000 millones de dólares en 2020.

El reto de crear un biosimilar

El desarrollo de biosimilares comienza con una caracterización exhaustiva del producto innovador para detallar los atributos estructurales clave que se traducirán en especificaciones para un producto biosimilar.

Debido a que el producto original tiene una variación inherente entre lotes, y los atributos pueden cambiar con el tiempo y los ciclos de mejora del proceso, los atributos de calidad deben ser evaluados a través de múltiples lotes (dos años de historial de lotes se ha mencionado anecdóticamente en las reuniones de la industria) para definir la variación del producto innovador para establecer las especificaciones del biosimilar.

Una vez que se conoce el producto innovador objetivo, se puede diseñar un proceso de producción de un biosimilar para alcanzar las especificaciones del innovador. Los datos típicos de estos estudios detallarán los atributos de la estructura primaria (secuencia y modificaciones), los perfiles de degradación, los estudios de estructura de orden superior, incluida la agregación, y los perfiles de impurezas de la proteína de la célula huésped.

Conocimientos de caracterización de biosimilares

La solución de plataforma biofarmacéutica con software UNIFI, que incluye un ACQUITY UPLC H-Class Bio y un espectrómetro de masas Xevo G2-XS QTof.
La solución de plataforma biofarmacéutica con software UNIFI, que incluye el ACQUITY UPLC H-Class Bio, el espectrómetro de masas Xevo G2-XS QTof, así como preparación de muestras, estándares analíticos y columnas para moléculas grandes.

Waters lleva más de 10 años trabajando en el desarrollo de tecnologías analíticas e informáticas centradas en la biofarmacia que ayuden a los científicos analíticos a afrontar los retos de caracterización y comparabilidad planteados por los reguladores para las aprobaciones de innovadores y biosimilares.

Actualmente, nuestra solución de plataforma biofarmacéutica con UNIFI combina los flujos de trabajo críticos necesarios para el análisis de medicamentos bioterapéuticos y biosimilares.

Esta plataforma de análisis de alta resolución se puede configurar para dar soporte a los entornos de los laboratorios biofarmacéuticos que operan en entornos de descubrimiento/desarrollo temprano, así como a los de desarrollo posterior que operan bajo estrictos requisitos de cumplimiento.

Fundamentalmente, el software UNIFI puede desplegarse en toda una organización bioterapéutica, desde el descubrimiento de fármacos hasta el control de calidad. La plataforma moderniza la forma en que los laboratorios adquieren, comparten y comunican los datos; todos los datos pueden almacenarse en un servidor central y acceder a ellos desde los PC de los clientes.

En la actualidad, los grupos de trabajo UNIFI pueden configurarse para admitir hasta dos sistemas UPLC/MS y otros cuatro sistemas UPLC sólo con detección óptica. En el futuro, los despliegues empresariales completos ampliarán estas capacidades a múltiples laboratorios y a través de ubicaciones geográficas.

Estudio de caso: Un estudio de comparabilidad de infliximab utilizando el software UNIFI

Waters utilizó la solución de plataforma biofarmacéutica con UNIFI para llevar a cabo un estudio de comparabilidad de modelos entre un nuevo candidato a biosimilar y su anticuerpo monoclonal innovador dirigido, infliximab(Remicade).

Remicade es un medicamento de gran éxito, comercializado por Johnson & Johnson, con unas ventas en Estados Unidos de 4.500 millones de dólares en 2015. El fármaco es un bloqueador del TNF y se utiliza actualmente para tratar trastornos autoinmunes como la enfermedad de Crohn y la artritis reumatoide. Sus patentes europeas han caducado, abriendo el camino a la competencia de los biosimilares, y las patentes clave de Estados Unidos expirarán en 2018.

En septiembre de 2013, se aprobaron en Europa los dos primeros biosimilares de infliximab de Celltrion (Remsima) y Hospira (Inflectra). EPIRUS Biopharmaceuticals, con sede en Estados Unidos, también comunicó datos positivos de fase 3 para un candidato a biosimilar de infliximab, BOW015, que había demostrado "comparabilidad clínica" con Remicade, medida por la respuesta ACR20 en pacientes con artritis reumatoide grave. EPIRUS informó en el verano de 2014 que había recibido las aprobaciones finales de comercialización y fabricación dentro de la India por parte de la DCGI. Este ensayo de fase 3 tampoco mostró diferencias significativas entre BOW015 y Remicade en cuanto a seguridad o inmunogenicidad.

Celltrion presentó una solicitud de biosimilar de infliximab para su producto Remsima ante la FDA estadounidense, que fue aprobada en la primavera de 2016. Se trata de la primera solicitud de anticuerpos monoclonales (mAb) que se evalúa en los Estados Unidos en el marco de la Ley de Asistencia Asequible. Pfizer anunció la disponibilidad en Estados Unidos de su biosimilar Inflectra (infliximab-dyyb) en otoño de 2016. Estos lanzamientos de biosimilares en 2016 están siendo seguidos de cerca por el sector.

Biosimilares de Infliximab: Comparación analítica

En el siguiente estudio de comparabilidad de biosimilares de infliximab realizado por los científicos de Waters, se compararon tres lotes de infliximab innovador (producido en la línea celular murina SP2/0) y tres lotes de un candidato a biosimilar de infliximab (derivado de células CHO) utilizando la solución de plataforma biofarmacéutica de Waters con UNIFI.

Las muestras se analizaron a nivel de la proteína intacta, las subunidades de la proteína, la digestión de la proteína, la fracción de glicanos liberados, y para los perfiles de agregación y variantes de carga. En la mayoría de los flujos de trabajo, cada una de las seis muestras se analizó por triplicado para establecer la reproducibilidad analítica de referencia.

La confirmación de la estructura primaria (es decir, la secuencia) es fundamental para establecer la biosimilitud con un producto innovador.

Esta cuestión puede abordarse indirectamente a nivel de los estudios de análisis de masas de anticuerpos intactos y de subunidades de anticuerpos, pero requiere estudios de mapeo de péptidos de alta cobertura para demostrar el orden lineal de los aminoácidos dentro de las cadenas de proteínas.

Estos análisis también sirven para definir la variación del producto en cuanto a atributos como la glicosilación, el procesamiento terminal y otras modificaciones de las proteínas.

 

Parte 1: Proteínas intactas

Análisis de la masa intacta

Un primer paso razonable en cualquier evaluación de IgG es una medición de la masa intacta que puede confirmar la masa molecular teórica y perfilar las modificaciones de mayor masa (por ejemplo, glicosilación, variantes de Lys C-terminal). Se trata de un experimento sencillo y rápido con una preparación mínima de la muestra, pero que puede proporcionar una gran cantidad de información; puede descalificar rápidamente los clones que producen un biosimilar candidato que contienen errores de secuencia o que tienen perfiles de variantes de modificación fundamentalmente alterados en relación con el innovador.

Las muestras intactas de infliximab se analizaron primero mediante un análisis UPLC/QTof MS de desalación rápida para generar perfiles de masa intactos comparativos entre las muestras del innovador y del biosimilar. El análisis demostró una masa consistente para una glicoforma común encontrada tanto en el innovador como en el biosimilar, pero mostró evidencia de diferencias en los perfiles de lisina terminal y de glicosilación.

Tales diferencias no descalifican a un candidato a biosimilar, sino que desafían a la organización del biosimilar a demostrar que las observaciones están dentro de la variabilidad del historial de producción, o que no afectan a la seguridad, estabilidad o eficacia de la molécula.

Utilizando el modo comparativo del software UNIFI para la revisión de datos y la elaboración de informes, pudimos comparar visualmente los resultados de este estudio, y posteriormente aplicamos plantillas predefinidas de informes UNIFI para automatizar la documentación de nuestros hallazgos sobre la abundancia relativa en todas las lisinas y glicovariantes detectadas.

A nivel de la masa intacta, es posible reducir la complejidad del resultado de la masa intacta mediante el uso de enzimas para eliminar las estructuras del N-glicano, o para eliminar los residuos de lisina C-terminal de la cadena pesada.

La eliminación de la cadena pesada deglicosilada demostró que los lotes del innovador tenían alrededor de un 40% de lisinas residuales, mientras que el biosimilar candidato tenía niveles de 60 o 70% de lisina. Este nivel era consistente de lote a lote y de inyección a inyección, estableciendo expectativas para la reproducibilidad de este tipo de ensayo de perfil, además de establecer la similitud de lote a lote dentro y entre cada muestra.

La eliminación de las lisinas C-terminales de la cadena pesada mediante la digestión con carboxipeptidasa B permite perfilar las glicovariantes con mayor claridad. Desgraciadamente, la carboxipeptidasa coeluyó con el mAb procesado con lis mediante el análisis en fase inversa, por lo que se aplicó la SEC/UV/MS desnaturalizante para observar las muestras después del procesamiento.

Waters desarrolló un método SEC/UV/MS desnaturalizante de 10 minutos (presencia de orgánico y ácido) para lograr la separación de base del candidato infliximab/biosimilar tratado con carboxipeptidasa B de la enzima y las sales.

En el software UNIFI, el diagrama de espejo de los datos resultantes reveló que las masas de las principales glicoformas coincidían con las muestras del innovador y del biosimilar, pero los niveles de las glicovariantes eran diferentes en el biosimilar en comparación con el infliximab innovador. En particular, el nivel de la glicoforma defucosilada, G0, era mayor en el infliximab biosimilar, mientras que los niveles de la glicoforma MAN5 y G0F-GlcNAc eran relativamente mayores en la muestra innovadora.

Vea el método y los datos de nuestra comparación estructural de infliximab y un biosimilar mediante el análisis de subunidades.

Análisis de subunidades: Análisis de masas de LC y HC reducidas

Para simplificar la complejidad causada por el perfil de dos conjuntos de glicoformas de cadena pesada a nivel de la proteína intacta, y para perfilar mejor las glicoformas de menor abundancia, redujimos (tratamiento con DTT) el anticuerpo a fragmentos LC y HC, y los analizamos mediante un método LC/MS de resolución (Columna ACQUITY UPLC BEH C4, fase inversa) para comparar los perfiles de masa de las muestras del innovador y del biosimilar.

Los espectros de masas deconvueltos mostraron que la masa de la cadena ligera del biosimilar candidato era consistente con la del innovador infliximab específicamente; los picos espectrales deconvueltos MaxEnt 1 para LC de los lotes de ambas muestras revelaron masas que eran consistentes dentro del error experimental. No se observó ninguna evidencia de glicosilación ni de otras modificaciones significativas en los perfiles de la cadena ligera, y los picos de nivel inferior en los espectros deconvolutados eran coherentes entre el innovador y el biosimilar candidato.

Los espectros de masas deconvueltos de las cadenas pesadas del innovador y del biosimilar candidato a infliximab mostraron de nuevo que las masas de las cadenas pesadas del biosimilar candidato eran coherentes con las del innovador, pero los niveles de las variantes de glico y lisina eran diferentes, como se vio por primera vez en el análisis intacto.

 

Siguiente: Análisis a nivel de péptidos

 

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