Desarrollo de métodos de separación para productos naturales: Preguntas y respuestas de un seminario web con el Dr. Tom Wheat

El desarrollo de métodos cromatográficos para productos naturales es un reto debido a la complejidad de la matriz de la muestra y la química del analito. Sin embargo, si se comprenden los parámetros fundamentales de su cromatografía y las estrategias para una detección eficiente, hay muchas maneras de superar estas dificultades.

Recientemente presenté un seminario web en el que describía algunas técnicas y herramientas utilizadas para desarrollar métodos de separación de productos naturales. La sesión suscitó muchas preguntas interesantes y un debate considerable. Comparto las respuestas a estas preguntas sabiendo que otros también se beneficiarán.

1. ¿Se necesitan normas para juzgar la pureza de los picos y para el seguimiento de los mismos?

No, no se necesitan estándares para la pureza y el seguimiento de los picos. Si se dispusiera de estándares, por supuesto que se utilizarían. Sin embargo, lo más frecuente es que utilicemos un procedimiento de catalogación. En cada experimento cromatográfico, registramos el espectro de masas y el espectro UV de cada pico. A continuación, buscamos espectros que coincidan en los demás experimentos cromatográficos. A menudo, observamos un pico con un espectro que no habíamos observado en un experimento anterior. Entonces, volvemos a visitar ese experimento anterior para buscar ese compuesto explícitamente. Estamos construyendo de forma iterativa un catálogo o biblioteca de los componentes de la muestra. A continuación, podemos hacer coincidir esas características espectrales a medida que cambiamos las características del medio de separación. Esto puede conducir a un mapa de retención para cada analito que puede utilizarse para controlar el desarrollo de la separación.

2. ¿Incorpora alguna vez otros detectores en un sistema de desarrollo de la separación?

Cuando hacemos separaciones, o cualquier tipo de trabajo analítico con una muestra de producto natural completamente desconocida, siempre tenemos que preguntarnos si se nos ha escapado algo. Rutinariamente incorporamos detectores ortogonales en nuestro sistema de separación. Es esencial que seleccionemos cada uno de los múltiples detectores como representante de un principio físico o químico diferente. La combinación de un detector UV con un detector de masas cumple ese criterio. Es muy habitual añadir al sistema un tercer detector, casi siempre un detector de dispersión de luz por evaporación. El eluato de la columna se reparte entre estos tres detectores, de modo que también podemos detectar compuestos que no tienen absorbancia UV ni ionización.

3. ¿Pueden utilizarse los métodos que concibas según estos principios para aislar los compuestos de interés?

Sí. Sin embargo, optaríamos por utilizar sólo componentes volátiles de la fase móvil para desarrollar la separación. Eso facilita la recuperación del material recogido simplemente evaporando o liofilizando la fracción. De todos modos, elegiríamos esas fases móviles si incorporáramos la espectrometría de masas o la detección por dispersión de luz evaporativa. Por lo general, intentaríamos obtener una resolución más completa si el método se va a utilizar para el aislamiento, de modo que podamos aumentar la carga de la muestra sin comprometer la pureza. Eso también nos permitiría escalar el método a tamaños de partícula mayores para mejorar la economía con muestras más grandes.

4. Para el cribado de incógnitas, ¿sería útil utilizar 50% de metanol, 50% de acetonitrilo (con ácido fórmico) como fase móvil B?

El uso de mezclas de disolventes orgánicos es una práctica bien establecida con una historia de éxito. Sin embargo, puede ser difícil hacer los experimentos de desarrollo de forma sistemática y controlada. He utilizado un protocolo con una serie de experimentos. La muestra se analiza primero, por ejemplo, en acetonitrilo al 100%. Luego se ejecuta una serie de pruebas con 67% de acetonitrilo/33% de metanol, 67% de metanol/33% de acetonitrilo y 100% de metanol. A partir de esos cuatro experimentos, se puede reconocer el efecto de las proporciones cambiantes de la mezcla de disolventes en la selectividad de la separación. Se puede elegir un punto intermedio para la mejor separación de forma sistemática. Para estos experimentos, lo más conveniente es utilizar un sistema de suministro de varios disolventes. Los cuatro disolventes pueden mezclarse a la carta, por lo que no es necesario preparar manualmente todas las fases móviles diferentes.

Estos puntos de discusión cubren el amplio espectro de principios analíticos aplicados a los métodos de separación de productos naturales. El desarrollo exitoso de este grupo de ensayos requiere prestar atención al control de la cromatografía y a los modos de detección, así como a la interpretación de los resultados. Aunque los productos naturales representan una clase de muestras especialmente difícil, las ideas que aquí se discuten pueden aplicarse a una amplia gama de tipos de muestras.

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