La integridad de los datos es importante: Picos de cromatografía desconocidos, no integrados o no detectados

En un blog anterior, hablé de la preocupación por los picos extraños que pueden aparecer en las separaciones de LC. Aunque puede haber muchas fuentes de picos no relacionados con las sustancias de ensayo, ¿cómo se puede decidir cuáles son legítimos y cuáles son una indicación de mala calidad? ¿Cuáles son inofensivos y cuáles peligrosos? ¿Cuáles son esperables y cuáles proceden de una contaminación o de un cambio en la fabricación? En este blog se analizarán las impurezas que puede haber en su producto, pero que no aparecen en su análisis.

Algunas ciencias básicas de la LC:

En primer lugar, permítanme que les haga un par de advertencias. La mayoría de las separaciones LC de control de calidad utilizan un detector UV, ajustado a una longitud de onda específica para la detección. Durante el desarrollo y la validación del método, la idoneidad de ese ajuste de longitud de onda se optimiza para la especificidad, es decir, para asegurarse de que los compuestos de interés se detectan en el ajuste, que la respuesta de los analitos en cuestión se detecta a niveles adecuadamente bajos y que la longitud de onda elegida es una opción robusta. Esto último es importante, ya que preserva la capacidad de los métodos para detectar los compuestos de interés, incluso con pequeños cambios en la longitud de onda UV que pueden producirse entre los detectores de diferentes instrumentos de LC. ¿Significa esto que todas las posibles impurezas, contaminaciones o productos de degradación se identificarán en un método de LC UV? Por supuesto que no. Muchos tipos de contaminantes pueden pasar desapercibidos en cualquier prueba de LC.

a) Contaminantes que no se extraen en la preparación de la muestra

b) Contaminantes que no tienen absorbencia UV (por ejemplo, la mayoría de los polímeros, los lípidos e incluso los azúcares no se detectan por detección UV

c) Contaminantes que sí absorben en UV, pero a una longitud de onda diferente a la utilizada para medir los componentes principales de la muestra.

Es importante tener en cuenta que los cromatogramas sin picos extraños no garantizan la ausencia de sustancias químicas inesperadas en la muestra, sólo que el método no detectó nada fuera de lo normal.

Búsqueda de contaminantes

Sin embargo, otras formas de detección pueden ayudar a sondear la muestra en busca de componentes inesperados.

Durante muchos años, el uso de múltiples longitudes de onda diferentes ha resultado útil para identificar sustancias adicionales en muestras de LC. Pueden utilizarse con dos fines: Buscar picos cromatográficos en longitudes de onda UV alternativas, y para examinar la consistencia de los espectros UV dentro de un pico. El análisis espectral a lo largo de la elución de un pico permite al científico buscar componentes adicionales con espectros UV diferentes, que eluyen al mismo tiempo que el compuesto principal, algo que se conoce como "coelución". En su forma más sencilla, un detector de múltiples longitudes de onda puede monitorizar 4 longitudes de onda diferentes. Si las lecturas a través de un pico se relacionan, un pico espectralmente homogéneo y de un solo componente produciría una relación en línea recta, sin perturbaciones espectrales causadas por una impureza adicional que absorbe el UV. Esta técnica para estimar la "pureza del pico" evolucionó hasta utilizar "todas las longitudes de onda" de un detector de matriz de fotodiodos, lo que permite al software identificar cualquier impureza absorbente de UV espectralmente diferente que coeluya bajo un pico medido.

Sin embargo, la pureza de pico medida por la homogeneidad espectral sólo puede detectar los contaminantes que absorben la luz ultravioleta y, en el caso de las impurezas coeluyentes, debe tener un espectro ultravioleta lo suficientemente diferente al del pico principal para que se pueda encontrar. La pureza espectral de los picos no puede utilizarse para cuantificar con exactitud las impurezas, pero puede ser una indicación útil de la presencia de un componente coeluyente no espectralmente homogéneo en el mismo tiempo de retención. La verdadera cuantificación requiere que el pico de la impureza esté bien separado de otros componentes y que se pueda calibrar la respuesta utilizando estándares de ese contaminante específico o estándares con una química muy similar.

Detectores universales

Existen detectores que no se basan en las propiedades de absorción UV de la molécula a prueba, sino que responden a cualquier componente del efluente de la columna, excepto la fase móvil. (1) Estos detectores pueden ser útiles cuando se buscan contaminantes, o durante el desarrollo del método, para evaluar la integridad de un método basado en UV. Sin embargo, la sensibilidad de detectores como los de índice de refracción, (muy utilizados para cuantificar azúcares y polímeros) casi nunca es suficiente para detectar los niveles requeridos en la mayoría de los ensayos farmacéuticos. Otros detectores universales son los detectores de conductividad y los detectores basados en aerosoles, los detectores de dispersión de luz evaporativa y la detección de aerosoles cargados.

La EM, como herramienta de detección, también podría describirse como universal, ya que cada molécula tiene una masa, pero no todas las moléculas pueden cargarse en la forma gaseosa que requiere la EM, lo que significa que los contaminantes pueden pasar desapercibidos. Además, la detección por EM se utiliza generalmente en un modo más focalizado que la detección por UV.

Un detector de EM se "afina" para medir los iones producto o hijos de una masa muy específica, realizando una medición extremadamente selectiva, lo que es muy beneficioso cuando se mide en mezclas complejas.

Este tipo de detección por EM enfocada sólo es útil si se sabe qué contaminantes se buscan y se configura la EM para detectar esos contaminantes conocidos. La detección por MS sólo consigue la capacidad de "pescar" contaminantes si el analista recoge grandes cantidades de datos en rangos de masas, todos los cuales deben ser revisados en detalle.

Detección ortogonal

La detección por matriz de fotodiodos y espectrometría de masas (o cualquier otro detector ortogonal diferente) puede ayudar a los laboratorios de desarrollo y de control de calidad a escanear los componentes separados y a buscar los picos de UV o de MS con una configuración de parámetros diferente a la del método principal. Recoger simultáneamente los espectros UV y MS puede ayudar a:

a) asegurar la ausencia de contaminantes con propiedades químicas similares a los principales compuestos de interés y

b) dar al químico más información de identificación sobre los picos extraños que aparecen en un cromatograma.

En los casos de picos que provienen del sistema, o de la preparación de la muestra, o que aparecen en las inyecciones en blanco (es decir, los que comentamos en el último blog y que podrían y deberían ser ignorados por el analista), el espectro UV o el espectro MS pueden proporcionar la confianza de que la fuente del pico está correctamente identificada. Igualmente, si la información espectral es inusual o no coincide con un componente que esperamos ver, entonces la información estructural adicional de estos detectores puede ayudar a resolver la identidad y la fuente de este contaminante. Sin embargo, como se ha mencionado, es importante recordar que algunos compuestos pueden ser invisibles incluso para los detectores de EM.

Conclusión

Entender las limitaciones de la detección cromatográfica es importante para comprender las preocupaciones sobre las impurezas en los productos farmacéuticos, específicamente las impurezas desconocidas o inesperadas no identificadas y caracterizadas previamente durante la validación del proceso y los estudios de formulación.

A medida que las capacidades de detección mejoran, ya sea debido a la mayor sensibilidad que ofrece la técnica de separación o a la tecnología de detección, la revelación de impurezas no vistas anteriormente puede representar un reto considerable. Los niveles nuevos o elevados de impurezas pueden crear una carga normativa de trabajo analítico adicional y evaluaciones de seguridad, todo lo cual debe comunicarse a las autoridades sanitarias. Sin embargo, no revisar y mejorar deliberadamente los métodos analíticos, por temor a tales descubrimientos, no sirve para la seguridad del paciente. Desgraciadamente, en las empresas reguladas de hoy en día, el avance y la mejora de los métodos analíticos se considera a veces una aspiración innecesaria, especialmente cuando el método analítico tradicional existente ya ha pasado el examen de los reguladores farmacéuticos.

Sin embargo, los planes actuales de Gestión del Ciclo de Vida de los Métodos, y el desarrollo de métodos analíticos de calidad para toda la vida, proporcionan una guía para evaluar continuamente el rendimiento de los métodos, y abren un marco normativo en el que los métodos analíticos, al igual que los procesos de fabricación, pueden mejorarse al tiempo que se reducen las cargas de documentación y registro de los cambios en los métodos validados. Consulte nuestro sitio web sobre la gestión del ciclo de vida de los métodos (MLCM) para obtener más información.

Y haga clic en este enlace para obtener información sobre los detectores de espectrometría de masas adecuados para los laboratorios de control de calidad que utilizan Empower 3.

Referencias y recursos adicionales

(1) Clasificación de los detectores

Impurezas de nitrosamina: La necesidad de verificar

Cómo evitar la próxima crisis de las nitrosaminas: 5 lecciones aprendidas sobre la detección de impurezas