Las columnas también importan: cómo mejorar la proteómica LC-MS de nano y microflujo teniendo en cuenta la propia separación

Markus Wanninger

Tiempo de lectura: 7 minutos

Parte 1: Cómo una configuración de trampa y elución puede resolver muchos problemas en la LC-MS de nanoflujo y microflujo proteómico

En conversaciones con científicos que trabajan activamente con sistemas LC-MS de nanoescala y microflujo (por ejemplo, en proteómica y mapeo de péptidos), me parece interesante que se dedique una gran cantidad de esfuerzo a la configuración del sistema, como las conexiones de fluidos o los parámetros de recogida de datos de MS.

Aunque es obvio que son importantes, lo que me sorprende es que se dedique comparativamente poco tiempo a considerar la elección de las fases estacionarias para las columnas trampa y analíticas. Se trata de un péptido, así que se van a utilizar columnas C18, ¿no? No exactamente.

En mi serie de tres partes, vamos a explorar cómo un emparejamiento óptimo de fases estacionarias puede mejorar en gran medida sus resultados de LC-MS de nanoflujo y microflujo.

Al considerar las opciones de nano y microcolumnas, a menudo se pasan por alto dos aspectos:

  • La captura y los diferentes conjuntos de configuraciones de captura, que tienen un propósito específico y ayudan al científico a alcanzar su objetivo de optimizar las separaciones y el rendimiento de las muestras
  • La elección de una fase estacionaria y de combinaciones de fases estacionarias para las columnas trampa y las columnas analíticas y el impacto que esto puede tener en el resultado del análisis, desde la resolución, la anchura de los picos y la capacidad de los mismos hasta, esencialmente, el número de péptidos identificados u otras especies de interés.

Veamos con más detalle los fundamentos del trapping y las ventajas y consideraciones para implementar un paso de trapping en una separación de LC.

Sabemos que la LC-MS de nano y microflujo aprovecha la miniaturización de la cromatografía y de la interfaz LC-MS al menos de dos maneras significativas. Los pequeños volúmenes de muestra y la eficacia de la ionización y el muestreo de la EM, así como la reducción de los efectos de la matriz, tienen un impacto positivo en la relación señal-ruido, o la sensibilidad, del ensayo de LC-MS.

Problemas volumétricos en LC-MS de nano y microflujo

Sin embargo, la mayor sensibilidad de los ensayos de nanoLC puede verse fácilmente comprometida por métodos experimentales deficientes. El reducido volumen de la columna hace que las LC de nano y microflujo sean más vulnerables a incompatibilidades en las condiciones cromatográficas que podrían no tener impacto en una columna analítica de mayor escala.

Por ejemplo, una columna de diámetro interior (D.I.) de 75 µm para nanoLC tiene un volumen de columna 780 veces menor que una columna analítica de 2,1 mm de la misma longitud. Inyectar, por ejemplo, una muestra de 5 µl directamente en una columna de 75 µm de diámetro interior sería lo mismo que inyectar 3,9 mL de muestra en una columna de 2,1 mm de diámetro interior. Y lo más probable es que eso se convierta en un lío cromatográfico.

Con estas cantidades de inyección, las partículas u otras especies problemáticas, como las proteínas o los lípidos residuales, pueden mostrar su carácter problemático en pocas inyecciones. La entrada de la columna de nanoLC podría bloquearse o el relleno de la columna podría ensuciarse y perder su retentividad. Además, a estos volúmenes de inyección, la fuerza del disolvente de cualquier paso de preparación de la muestra (en línea o fuera de línea) también podría alterar la separación cromatográfica.

Y ni siquiera estoy mencionando los increíbles tiempos de carga de la muestra en la columna analítica: Con un caudal típico de 300 nL/min, se necesitarían unos 17 minutos para lavar un volumen de 5 µl. Si el bucle de muestra es más grande, el tiempo necesario será aún mayor.

Columnas trampa

Aquí es donde una configuración de trampa y elución resuelve muchos problemas en la LC-MS de nano y microflujo proteómico. Con esta configuración, la muestra se inyecta y enfoca primero en la columna trampa. Una columna trampa está diseñada para permitir que este paso se realice a altas velocidades de flujo en un periodo de tiempo relativamente corto, utilizando un hardware de mayor diámetro interior y partículas más grandes que la columna analítica respectiva.

La trampa filtra las impurezas o las especies no deseadas de la muestra, pero retiene los analitos de interés. En el paso siguiente, los analitos de interés atrapados se reconstituyen en la fase móvil y se eluyen en la columna analítica a la velocidad de flujo más baja para la separación analítica.

Ventajas de la captura:

  • Mayor velocidad de carga de la muestra
  • Mayor carga volumétrica y, por lo tanto, mayor carga de masa en la columna, lo que se traduce en un mayor rango dinámico del ensayo de nanoLC-MS
  • Limpieza adicional de la muestra antes de la inyección en la columna analítica

Básicamente, una columna trampa es una zona de espera y limpieza para la muestra inyectada antes de que los componentes se eluyan y se separen con alta resolución en la columna analítica posterior.

Por supuesto, el uso de la técnica de "trap-and-elute" requiere un poco de desarrollo del método. Mientras que un método de trampeo bien optimizado puede lograr todos los beneficios descritos, un método de trampeo mal diseñado puede dar lugar no sólo a la pérdida de intensidad de la señal de la EM, sino también a la pérdida del analito.

Configuraciones de sistemas de captura y descarga

Las dos configuraciones principales del sistema de elución de la trampa son la elución de la trampa hacia delante, que es la configuración más básica, o la configuración más sofisticada de la elución de la trampa hacia atrás. Cada una de estas configuraciones tiene sus ventajas e inconvenientes.

En la configuración de la trampa de avance-eliminación, la muestra simplemente se carga desde la válvula de inyección a la columna de la trampa, se limpia y se empuja a través de la salida de la columna de la trampa a la columna analítica. La válvula de la trampa permite que el flujo no llegue a la columna analítica durante el paso de carga y limpieza de la trampa. Esta vía de flujo se cerrará y el flujo será forzado hacia la columna analítica durante el paso de elución.

En la configuración de la trampa inversa, la muestra también se cargará en la columna de la trampa en la dirección normal del flujo. Sin embargo, después de completar el paso de carga y limpieza, la dirección del flujo se invierte cambiando la válvula de la trampa. La muestra se eluye hacia atrás, a través de la entrada de la columna trampa hacia la columna analítica. Una bomba secundaria se encarga de que la columna analítica vea siempre el flujo de la fase móvil, incluso durante la etapa de carga.

Carga y elución de la muestra

Antes de hablar de la captura y la elución de la muestra, sólo quería recordar al lector la curva de Van Deemter y su significado para la cromatografía: básicamente afirma que si una banda cromatográfica migra a lo largo de un lecho empacado a una velocidad lineal no óptima, la banda cromatográfica experimenta un grave ensanchamiento. Este efecto es más pronunciado para las partículas más grandes, por ejemplo, las utilizadas en las columnas trampa, que para las partículas más pequeñas, como las utilizadas en las columnas analíticas de nano y microflujo. El inclinado puede querer leer este magnífico artículo sobre el ensanchamiento de la banda en cromatografía.

En ambos casos de atrapamiento, el paso de carga se produce a altas velocidades de flujo y a través de la entrada de la columna trampa. En el mejor de los casos, la banda de analitos inyectada es retenida y, por lo tanto, concentrada cerca de la entrada de la columna trampa. El grado de concentración de los analitos y la cantidad de volumen de la columna que ocupan depende, por supuesto, de la hidrofobicidad del analito.

Al eluir, el caudal se reduce para maximizar la eficacia de la separación analítica en la nanocolumna, normalmente a un caudal muy bajo adecuado para los pequeños orificios de la nanocolumna. Si el analito se eluye en la dirección de avance (la misma dirección que el flujo de carga), la muestra tiene que migrar a lo largo de todo el lecho empacado de la trampa a una velocidad inferior a la óptima (no hay que olvidar que el hardware de la trampa y las partículas son mucho más grandes que las de las nanocolumnas), lo que es una receta para un ensanchamiento significativo de las bandas.

Cuando la trampa se eluye en dirección de flujo inversa, la banda del analito sólo tiene que migrar una corta distancia a lo largo del lecho empacado - el efecto de ensanchamiento de la banda será significativamente menos pronunciado. Este menor ensanchamiento de la banda es una ventaja significativa del método de elución con trampa inversa. Existe una forma de revertir en cierta medida el efecto de ensanchamiento de banda. El método no siempre es posible, pero puede ser potente si se utiliza correctamente.

Siempre depende de su muestra y de su matriz...

En esta entrada he abordado las dos configuraciones más comunes del sistema de trampa y elución y he señalado el impacto potencial en la calidad de la separación cromatográfica, dependiendo de si se utiliza el método más sencillo de trampa y elución hacia delante o el más complicado de trampa y elución hacia atrás. La respuesta correcta, por supuesto, no es definitiva y será muy diferente según la naturaleza de la muestra y la matriz de la misma. Sin embargo, creo que las reflexiones anteriores deberían tenerse en cuenta a la hora de evaluar su separación por nano o microflujo. Porque, al final, probablemente a todos nos importa más el número de proteínas y péptidos identificados o la precisión de la cuantificación a la hora de elegir un método sobre el otro.

En el próximo post hablaré del impacto de las fases estacionarias y de cómo elegir la fase estacionaria óptima para la LC-MS de nano y microflujo para el análisis de péptidos.

 

Recursos adicionales

Mi colega Patty Sun escribió dos maravillosos artículos sobre la mejora de la eficacia del muestreo y los efectos de la matriz. Recomiendo su lectura para profundizar en estos temas: