Las columnas también importan: Cómo elegir las condiciones óptimas para la LC-MS de nanoflujo y microflujo

Parte 3: Optimización de las condiciones de captura

En la anterior entrega de esta serie se trataron los detalles, efectos y ventajas de las fases estacionarias para el análisis proteómico de péptidos y cómo la retentividad de la trampa y la columna analítica pueden mejorar su separación de péptidos. En esta ocasión, quería referirme brevemente a las condiciones de atrapamiento, como el caudal y el volumen de atrapamiento, ya que, según mi experiencia, es un parámetro que a menudo se descuida.

• Parte 1: Cómo mejorar la proteómica LC-MS de nano y microflujo teniendo en cuenta la propia separación
• Parte 2: Elección de la mejor fase estacionaria para NanoFlow y Microflow LC-MS
• Parte 3: Optimización de las condiciones de captura

Los fundamentos de la captura

Las columnas de trampa suelen tener un diámetro interior mayor y están rellenas de partículas más grandes que su homóloga analítica. Esto permite cargar un mayor volumen de muestra a velocidades de flujo más elevadas, como ya se comentó en un artículo anterior. El atrapamiento efectivo captura todos los analitos de interés en una muestra más grande mientras descarta los compuestos que interfieren. Esto requiere que los compuestos más hidrofílicos sigan siendo retenidos durante el paso de trapping, y la capacidad de eluir todos los analitos en pequeños volúmenes para reenfocar con éxito las bandas en la columna analítica.

En general, el uso del trapping puede aumentar el rango dinámico de sus análisis al permitir inyectar más muestra y reducir los efectos negativos de la matriz de la muestra.

Consideraciones para optimizar las condiciones de captura

La pérdida de péptidos hidrofílicos durante la etapa de atrapamiento no es infrecuente, ya que la recuperación de péptidos depende en gran medida de la retención. La recuperación de péptidos puede optimizarse ajustando las condiciones de captura en consecuencia.

Como la retención de la columna trampa es idealmente inferior a la de la columna analítica y, por tanto, es fija, uno de los parámetros que debe ajustarse es la fuerza del disolvente durante el proceso de captura. Los disolventes de menor fuerza ayudarán a capturar mejor las especies menos retentivas en la columna trampa.

Además, el volumen de carga debe ser lo suficientemente grande como para transportar la muestra desde el bucle de inyección hasta la trampa y para lavar los compuestos no deseados, como las sales y otras interferencias iónicas. Pero el volumen de captura debe ser lo suficientemente pequeño como para evitar el lavado de los péptidos débilmente retenidos. Esto también requiere tener en cuenta la composición del disolvente de la muestra inyectada y cómo puede afectar a la composición final del disolvente durante el proceso de carga. Además, es necesario optimizar la velocidad de flujo durante el proceso de captura.

La figura 2 muestra cómo la velocidad de flujo y la duración del atrapamiento y, por tanto, el volumen total de atrapamiento resultante afectan a la recuperación de péptidos cuando se utiliza una concentración de disolvente. Cuando la muestra se atrapa con demasiado volumen, las posibilidades de pérdida de péptidos hidrofílicos aumentan drásticamente.

El cambio de la composición del disolvente también puede influir en la recuperación de péptidos, ya que los disolventes más fuertes son más propensos a lavar los péptidos débilmente retenidos.

La optimización de la metodología de trampeo no debe ser un paso descuidado al desarrollar un método de trampeo y elución para análisis LC-MS de nano o microflujo. Es conveniente que conozca la retentividad y selectividad global de las fases estacionarias de la columna de trampa, así como de la columna analítica. Un método de trampa y elución bien ajustado aumentará el rango dinámico de su método, ya que le permite inyectar una cantidad significativamente mayor de muestra, y también aumentará la sensibilidad general del análisis debido a la disminución de los efectos de la matriz.

Recursos adicionales:

• Qué es el microflujo LC
• Microflow LC ofrece una mayor sensibilidad gracias a la reducción de los efectos de la matriz
• Nano y Micro columnas LC de Waters
• Libro blanco: Consideraciones para la selección de las fases estacionarias óptimas para la nano-cromatografía de trampa y elución proteómica
• ¿Desea una inmersión más profunda? Reproduzca nuestro reciente seminario web organizado por SelectScience, Considerations for Selecting the Optimal Stationary Phases for Proteomic Trap-and-Elute NanoLC-MS (Consideraciones para la selección de las fases estacionarias óptimas para la NanoLC-MS proteómica), con la participación de Moon Chul Jung, Ph.D., de Waters