Cómo evitar la escasez de reactivos para la PCR: El papel de las columnas de HPLC preparativa

Nick Zampa

,
Tiempo de lectura: 6 minutos
Sonda PCR Primer

Sonda PCR PrimerLos diagnósticos críticos del SARS-CoV-2 basados en la PCR no han sido inmunes al interrupciones en la cadena de suministro tan común durante la pandemia de COVID-19. Mientras que el la mayor perturbación para las pruebas basadas en la PCR era los kits de extracción de ARN, las enzimas y los cebadores de PCR también se han visto afectados. En Waters, hemos seguido de cerca el papel que desempeñan las columnas de HPLC preparativa de alta calidad en la cadena de suministro de cebadores y sondas de PCR. A medida que avancemos en esta pandemia y más allá, seguiremos ayudando a garantizar la calidad y el suministro adecuados de cebadores y sondas de PCR para el diagnóstico y el uso rutinario.

Antecedentes de los cebadores y sondas de la RT-PCR

El diagnóstico oportuno de la infección vírica por SARS-CoV-2 ha sido fundamental para gestionar la nueva pandemia de coronavirus. De hecho, COVID-19 nos enseñó que la disponibilidad temprana de diagnósticos de calidad es fundamental para el éxito de la gestión de la pandemia en general.

Muchos ensayos de COVID-19 con autorización de uso de emergencia en los EE.UU. y la UE emplean kits de diagnóstico RT-PCR, que utilizan oligonucleótidos como cebadores y sondas durante la amplificación y la detección.

  • Sondas de RT-PCRfluorescentes (de doble etiqueta): Las sondas de RT-PCR son oligonucleótidos que se unen a una secuencia diana específica de interés. En el extremo 5' de la sonda se une un fluoróforo informador, mientras que en el extremo 3' se une un quencher. La proximidad del quencher y del fluoróforo inhibe la señal fluorescente. Durante la amplificación, una transcriptasa inversa transcribe el ADN del extremo 5' al 3'. Esto libera el fluoróforo de la sonda y el quencher, dando lugar a una señal fluorescente medible.
  • Cebadores PCR: Los cebadores de la PCR son oligonucleótidos cortos de una sola hebra que se unen por delante de la secuencia objetivo de interés. Las ADN polimerasas, incluida la transcriptasa inversa, sólo pueden transcribir el ADN de una cadena existente en la dirección 5' a 3', y no crear nuevo ADN a partir de una cadena molde sola. Por lo tanto, se requieren cebadores de oligonucleótidos para una reacción de PCR.

Columnas de HPLC preparativa y diagnósticos de RT-PCR

La comprensión de la importancia de las columnas de HPLC preparativa para la fabricación de diagnósticos de RT-PCR puede dividirse en dos cuestiones.

¿Cuál es el parámetro de rendimiento más importante para una prueba de diagnóstico RT-PCR durante una pandemia?

¡Es la sensibilidad!

Evitar los falsos negativos es fundamental durante una pandemia. El control de la propagación de la enfermedad requiere que no diagnostiquemos erróneamente a los pacientes que no tienen la enfermedad, cuando en realidad sí la tienen. En consecuencia, el parámetro de rendimiento más importante para una prueba de diagnóstico es la sensibilidad. La sensibilidad analítica y unos límites de detección (LoD) suficientemente bajos son necesarios para garantizar unos falsos negativos mínimos.

Sonda PCR Primer 2

Entonces, ¿qué tienen que ver las columnas de HPLC preparativa con la sensibilidad?

Se trata de la pureza.

Como he aprendido al hablar con nuestros clientes colaboradores, se recomienda la purificación por HPLC en fase inversa (principalmente con emparejamiento de iones) para lograr la pureza de los cebadores y las sondas necesaria para realizar pruebas de diagnóstico basadas en la PCR suficientemente sensibles y precisas. Demasiadas secuencias de fallo N-1 dan lugar a una reducción de la sensibilidad. La base incorrecta en su cebador y no es específica para la diana de interés. Etiqueta fluorescente libre y su ruido de fondo aumenta. Falta el fluoróforo o el quencher de un porcentaje de sondas y la sensibilidad puede reducirse.

Aunque los requisitos de pureza varían de una prueba a otra y de una empresa a otra, a menudo se solicita una pureza superior al 85%. A través de una rápida búsqueda de algunos de los principales fabricantes de oligonucleótidos del mundo, encontrará orientación de expertos sobre las técnicas de purificación para diferentes tipos de cebadores y sondas de PCR. Casi universalmente, se recomienda la purificación por HPLC para los ensayos de PCR sensibles, especialmente los utilizados como diagnóstico.

En última instancia, los fabricantes de kits de diagnóstico tratan de reducir el riesgo de que la amplificación por PCR falle debido a cebadores y sondas de mala calidad o impuros. Aunque el rendimiento del diagnóstico es una combinación de parámetros más allá de la pureza, ésta es un factor que puede controlarse en el diseño del kit de prueba.

Columnas de HPLC preparativa de Waters y suministro de cebadores y sondas de PCR

Podemos abordar la relación entre el suministro de cebadores y sondas PCR y las columnas de HPLC preparativa de Waters respondiendo a tres preguntas.

¿Cuál es el vínculo entre las columnas de HPLC preparativa y las cadenas de suministro de cebadores/sondas?

Al permitir a los fabricantes cumplir con los requisitos de alta pureza de las sondas de PCR de diagnóstico, las columnas de RP-HPLC preparatorias son un componente crítico para garantizar un suministro adecuado de diagnósticos sensibles basados en la PCR para COVID-19. Por ello, es deseable el uso de columnas de alta calidad, capaces de alcanzar la pureza necesaria y proporcionar un rendimiento suficiente. A menudo se opta por la HPLC en lugar de los formatos basados en cartuchos debido a la mayor capacidad y mejor resolución (que se traduce en una mayor pureza) asociadas a las columnas. Esta combinación de mayor capacidad y pureza puede ser esencial para producir urgentemente material de alta demanda en una pandemia.

Bien, ¿qué podría ir mal en la depuración que pudiera afectar a mi suministro?

  • Imagina que una columna se anula de forma imprevisible o falla a mitad de carrera. Se pierde la tirada. Se pierden las muestras. Se retrasa.
  • Imagine que ha desarrollado su método a escala analítica, ha aplicado buenas reglas de escalado y, de repente, el rendimiento a escala preparativa es una pesadilla. Vuelve a la mesa de dibujo. Más retraso.
  • Imagina que recibes una nueva columna del mismo o diferente lote que una columna anterior. Comienza su ejecución y nota que no tiene el mismo rendimiento. Es posible que tenga que volver a desarrollar u optimizar su método para tener en cuenta esta mayor variabilidad. Retraso de nuevo.
  • Imagínese que pide una columna y se entera de que su proveedor está retrasando el suministro. ¿Logrará sacar este material a la calle?

Los retrasos en la producción podrían dar lugar a retrasos en las pruebas de los pacientes. En tiempos de necesidad urgente, usted no tiene tiempo para enfrentarse a estos retos. Quiere hacerlo bien a la primera, siempre.

Genial, pero ¿qué puede ofrecer Waters para ayudarme a cumplir mis plazos?

En Waters, nos esforzamos por reducir su exposición al riesgo de estos fallos proporcionándole soluciones de alta calidad, innovadoras y disponibles. Ofrecer garantías contra cada uno de los retos mencionados requiere una solución específica.

  • Premadura y corta vida útil: Un lecho empacado debe ser lo suficientemente denso como para soportar las fuerzas de compresión del fluido que se encuentran durante su uso. A medida que aumentan los diámetros de las columnas, es cada vez más difícil alcanzar la densidad de lecho necesaria para un rendimiento estable a largo plazo. Al emplear la tecnología OBD™ patentada y los procesos de empaquetado, podemos empaquetar columnas para cada tipo de partícula y geometría con densidades predecibles y uniformes en toda la longitud de la columna. No hay vacíos ni fallos imprevisibles y prematuros.
  • Escalamiento deficiente: Incluso cuando las columnas preparativas utilizan las mismas partículas y la misma química que las columnas analíticas, la buena escalabilidad no está necesariamente asegurada debido a las diferencias en la densidad del lecho. Las columnas preparativas OBD de Waters están diseñadas para que las densidades del lecho a escala preparativa coincidan con las densidades del lecho a escala analítica. Con una gama de partículas escalables, podemos ayudar a garantizar que un método se escale correctamente la primera vez, todas las veces.
  • Irreproducibilidad y suministro: Waters es propietaria de toda la cadena de suministro y fabricación después de las materias primas para nuestras columnas principales. Esto permite un sólido control de calidad en todo el proceso de fabricación de las columnas.
    • Producimos con frecuencia pequeños lotes de medios a partir de materias primas
    • Diseñamos, mecanizamos y montamos nuestras propias columnas
    • Empaquetamos nuestras propias columnas

Esto también reduce nuestro riesgo de interrupciones imprevistas en la cadena de suministro. Y si esas interrupciones se producen, nos permite ajustar rápidamente las existencias. Como socio suyo, cuando nosotros reducimos los riesgos de suministro y calidad, usted también lo hace. ¿Podemos garantizar el stock o la rapidez de entrega de cualquier columna, en cualquier momento? No, por supuesto que no. ¿Pero estamos preparados para mitigar los riesgos de la cadena de suministro para usted? Creo que sí.

Nos esforzamos por ofrecerle siempre un producto de la máxima calidad y rendimiento cuando la necesidad es más urgente.

Regístrese ahora para nuestro seminario web de la serie Spotlight de COVID-19 (10 a.m. ET, 31 de marzo de 2021) - Martin Gilar explorará la cromatografía en fase inversa de pares de iones para oligonucleótidos, incluyendo la purificación para sondas PCR

 

 

Información y recursos adicionales:

¿Tiene alguna idea, pregunta o propuesta de colaboración? ¡Queremos saber de ti! Si aún no conoces a tus contactos locales de Waters, ponte en contacto con el Equipo de Respuesta a la Innovación de COVID para realizar una consulta científica o proponer una colaboración.