Automatización de la desconvolución de masas intactas: Ya es hora

Desde que el Dr. John Fenn puso las "alas a los elefantes" que describían sus primeros trabajos sobre la espectrometría de masas por electrospray de macromoléculas, nos hemos enfrentado al reto de identificar los medios más eficaces para simplificar los espectros de carga múltiple que generan estas grandes moléculas. Desde un sencillo algoritmo algebraico que él y su estudiante Matthias Mann demostraron por primera vez en el artículo seminal de 1989 sobre la espectrometría de masas por electrospray de proteínas (ESI-MS), hasta el uso de algoritmos más sofisticados de procesamiento de máxima entropía y bayesiano, ha habido continuos intentos de producir los espectros de masas de carga cero deconvolutos más precisos y completos a partir del análisis de macromoléculas biológicas por electrospray LC-MS.

El viaje hacia la automatización del análisis LCMS biofarmacéutico

Waters lleva mucho tiempo avanzando en los análisis de masas intactas. En la conferencia de John Fenn sobre el Premio Nobel de 2002(John B. Fenn - Nobel Lecture - NobelPrize.org), reconoce a Brian Green (*), de VG Analytical (un progenitor de la Espectrometría de Masas de Waters), por inspirar los esfuerzos para observar moléculas más grandes, y arreglar "para que VG nos prestara un analizador cuadrupolar usado que podía pesar iones con relaciones masa/carga de hasta 1500" para que pudieran investigar esta posibilidad. Brian fue el impulsor del desarrollo de la ESI dentro de VG y posteriormente formaría una colaboración clave con el Dr. John Skilling del Instituto Cavendish de la Universidad de Cambridge y fundador de MaxEnt Solutions Ltd. La publicación resultante en 1992, titulada "Disentangling ESI Spectra with Maximum Entropy", sentó las bases de la primera deconvolución espectral comercial de macromoléculas basada en la máxima entropía.

Este esfuerzo por avanzar en la deconvolución espectral continuó cuando Micromass surgió de VG/Fisons, y finalmente evolucionó hasta convertirse en una parte totalmente integrada de Waters Corporation, donde el Dr. Keith Richardson, científico principal de investigación, continuó el trabajo con el Dr. Skilling, con la modernización de los algoritmos MaxEnt1 y MaxEnt3 para los sistemas informáticos modernos y su optimización para soportar datos espectrales de MS de tiempo de vuelo (TofF) de mayor resolución. Estas mejoras están disponibles no sólo en MassLynx, sino también en BiopharmaLynx, la primera herramienta de software diseñada para agilizar y automatizar el procesamiento de datos de mapeo de proteínas y péptidos intactos.

El primer algoritmo de desconvolución universal

La colaboración entre el Dr. Skilling y el Dr. Richardson, y las continuas mejoras en la potencia de cálculo también han dado lugar al desarrollo del algoritmo de deconvolución BayesSpray, el primer "algoritmo de deconvolución universal". Esto dio paso a la llegada de un verdadero proceso de deconvolución bayesiana, capaz de deconvolucionar los espectros de masas de especies de menor y mayor peso molecular - para datos de EM de menor y mayor resolución. Este algoritmo, que apareció por primera vez en un póster de la Sociedad Americana de Espectrometría de Masas (ASMS) en 2010, se incorporó posteriormente a la plataforma informática UNIFI para el procesamiento de datos de masa descendentes e intactos.

El avance en este ámbito no ha sido sólo una historia unida a las competencias en potencia informática. Al reconocer la necesidad de que estos algoritmos, cada vez más potentes, sean autosuficientes y se autooptimicen, hemos eliminado la necesidad de depender del uso de parámetros introducidos por el usuario para conseguir resultados precisos y significativos.

En las siguientes secciones se detalla el enfoque que hemos adoptado no sólo para acelerar el procesamiento de los datos de EM de electrospray de macromoléculas, sino para construir flujos de trabajo de deconvolución más inteligentes que:

• lograr este objetivo de reconocer automáticamente los picos cromatográficos
• determinar los mejores parámetros para el tratamiento de los espectros bajo estos picos
• devolver un resultado que pueda ser interpretado de manera significativa por quienes no son expertos en espectrometría de masas de proteínas

Desarrollo de la nueva aplicación waters_connect INTACT Mass: Proceso centrado en el usuario

Antes de empezar a desarrollar la nueva aplicación waters_connect INTACT Mass, hablamos con los usuarios de algoritmos de deconvolución en biofarmacia y conocimos a científicos que trabajaban con cientos o miles de macromoléculas diferentes cada semana. Nos fijamos el objetivo de apoyar a los usuarios que necesitan proporcionar un servicio de alta capacidad y alto rendimiento para la confirmación de masas y la determinación de la pureza. Nos planteamos el reto de proporcionar una forma de analizar una placa de 384 pocillos de muestras en la que cada muestra es una macromolécula única; hacer que los resultados de toda la placa estén disponibles uno o dos minutos después de que se haya completado la adquisición de datos de LC-MS; y hacer que los resultados estén disponibles inmediatamente para las muestras urgentes aunque los datos de otras muestras de la placa todavía se estén adquiriendo. Para alcanzar este objetivo, hemos realizado algunos cambios importantes en la arquitectura de nuestros algoritmos de deconvolución:

• Utilizar el multithreading para la deconvolución, de modo que se puedan deconvolucionar múltiples espectros de masas simultáneamente. Consideramos que esto era clave para garantizar que se pudieran deconvolucionar múltiples picos en el tiempo de una adquisición.
• Permite el procesamiento de datos en paralelo con la adquisición de datos. Esto significa que los resultados de una placa de 384 pocillos pueden estar listos poco después de que haya terminado la adquisición de datos. También significa que los científicos pueden proporcionar resultados urgentes para las muestras cuando otras muestras en la misma placa todavía se están analizando.

Para que los tiempos de respuesta sean rápidos, es importante que la velocidad de deconvolución se mantenga durante las grandes series. Cuando se analiza una placa de 384 pocillos, se están escribiendo y leyendo cantidades significativas de datos de una base de datos, mientras se deconvuelven los espectros de masas. Para complicar aún más las cosas, el análisis es cada vez mayor a lo largo de la tirada, ya que se adquieren más datos, lo que puede afectar aún más a los tiempos de lectura y escritura. Para garantizar que los científicos puedan ofrecer un tiempo de respuesta rápido para los flujos de trabajo de deconvolución de masas, probamos ampliamente el flujo de trabajo integrado INTACT Mass en un sistema en vivo durante el desarrollo, comprobando la velocidad de deconvolución a medida que avanza el análisis.

Desafíos de los usuarios que abordamos

• Desafíos que requieren nuevas capacidades en los flujos de trabajo masivos intactos de rutinaEl análisis de impurezas, los componentes inesperados en las muestras, los errores humanos, los artefactos en los espectros deconvueltos y el alto nivel de conocimientos necesarios para utilizar los algoritmos de deconvolución.
  • Nueva implementación: nos fijamos otro objetivo de automatizar la producción de espectros deconvueltos correctamente sin que el usuario tenga que suministrar las masas esperadas, los rangos de masa esperados o el rango de m/z de entrada. Teníamos en mente el análisis de impurezas, los estudios de degradación, la capacidad de utilizar métodos genéricos y la capacidad de realizar un análisis no dirigido cuando automatizamos la configuración de los parámetros para deconvolver los espectros de masas.
• Desafíos derivados de las terapias de nueva generaciónLos científicos de los laboratorios que trabajan con nuevas modalidades, como los nuevos oligonucleótidos de química personalizada, los nuevos péptidos de química personalizada y los conjugados, explicaron los problemas que plantea el uso de los algoritmos de deconvolución existentes debido a la limitada selección de modelos isotópicos: normalmente sólo tipos de macromoléculas naturales.
  • Nueva implementación: hemos decidido permitir a los usuarios crear sus propios modelos de isótopos. Esto mejora la precisión de la masa, y cuando se utilizan químicas personalizadas que incluyen elementos como el cloro, el científico tiene un espectro más sencillo de revisar.
• Desafíos derivados de la diversidad de clases de moléculas bioterapéuticasLos científicos también nos hablaron de los pros y los contras de los distintos algoritmos de deconvolución y de sus preferencias por los espectros de masas monoisotópicos y medios. Estaba claro que era necesario elegir los algoritmos.
  • Nueva implementación: hemos decidido ofrecer a los usuarios una opción de espectros MaxEnt1 y BayesSpray creados automáticamente. El algoritmo MaxEnt1, ampliamente utilizado y basado en la máxima entropía, produce excelentes espectros para macromoléculas de gran tamaño y es importante para comparar con los resultados heredados.
• Desafíos de la calidad de los datosLa creación de artefactos, que los usuarios señalan como un inconveniente de este algoritmo. Un algoritmo de muestreo anidado más reciente, BayesSpray, tiene importantes ventajas para los datos resueltos isotópicamente y sigue funcionando bien para los datos no resueltos isotópicamente de grandes macromoléculas.
  • Nueva implementación: ahora ofrecemos a los usuarios la posibilidad de elegir entre espectros de masas monoisotópicos y medios para BayesSpray y consideramos la velocidad de procesamiento en esta nueva implementación.

Ya es hora

La realización del objetivo de procesar automáticamente conjuntos de datos de EM por electrospray de macromoléculas en la aplicación waters_connect INTACT Mass ha tardado mucho en llegar, ya que han pasado 30 años desde la publicación de los datos espectrales de proteínas que nos abrieron los ojos a las posibilidades. Las mejoras en la potencia de procesamiento de los ordenadores personales, los avances en los algoritmos de deconvolución, desde el simple procesamiento algebraico hasta el análisis bayesiano de última generación, y la mejora constante de las capacidades de los sistemas de EM por electrospray nos han llevado a este punto en el que la creación de un espectro de carga cero a partir de datos espectrales de carga múltiple puede llevarse a cabo con éxito, y ya no con la necesidad de la intervención de un usuario experto.

Al final se trata de tiempo. Se trata del tiempo que se ahorra al realizar un análisis y comunicar el resultado. Se trata del tiempo necesario para coger a alguien sin experiencia en el arte de la espectrometría de masas de grandes moléculas y hacer que sea capaz de generar resultados de calidad. Se trata del tiempo que se ahorra al obtener el resultado correcto la primera vez que se analiza la muestra. Se trata, sin duda, de tiempo.

Recursos adicionales:

Blog: Ayudar a los laboratorios a abrazar la nueva era de la eficiencia

Blog: Conectando a los científicos con la informática de nueva generación

Blog: La nueva SELECT SERIES MRT redefine el rendimiento de la nueva generación de espectrometría de masas de alta resolución

*Tomamos nota con tristeza del fallecimiento de Brian Green, OBE en diciembre de 2021, y remitimos a los lectores al artículo de 1996 en Rapid Communications que recoge los detalles de los inicios de su carrera, una carrera científica que siguió progresando mucho después de su supuesta jubilación.