Herramientas analíticas para el desarrollo de biosimilares: Parte 3, Variantes de glicosilación, agregación y carga

Scott Berger

Tiempo de lectura: 8 minutos

Avances en la analítica de alta resolución para la caracterización de terapias innovadoras y biosimilares

Biosimilar de Infliximab: Una comparación analítica de las variantes de glicosilación, agregación y carga

En el siguiente estudio de comparabilidad de biosimilares de infliximab realizado por los científicos de Waters, se compararon tres lotes de infliximab innovador (producido en la línea celular murina SP2/0) y tres lotes de un candidato a biosimilar de infliximab (derivado de células CHO) utilizando la solución de plataforma biofarmacéutica de Waters con UNIFI.

Las muestras se analizaron para la fracción de glicanos liberados y para los perfiles de agregación y variantes de carga. En la mayoría de los flujos de trabajo, cada una de las seis muestras se analizó por triplicado para establecer la reproducibilidad analítica de referencia.

La confirmación de la estructura primaria (es decir, la secuencia) es fundamental para establecer la biosimilitud con un producto innovador. Esta cuestión puede abordarse indirectamente a nivel de los estudios de análisis de masas de anticuerpos intactos y de subunidades de anticuerpos, pero requiere estudios de mapeo de péptidos de alta cobertura para demostrar el orden lineal de los aminoácidos dentro de las cadenas de proteínas. Estos análisis también sirven para definir la variación del producto en cuanto a atributos como la glicosilación, el procesamiento terminal y otras modificaciones de las proteínas.

 

Herramientas analíticas para caracterizar un biosimilar

 

En esta serie de tres partes, estamos revisando cómo las tecnologías analíticas UPLC y QTof-MS, que han sido diseñadas a propósito para la caracterización biofarmacéutica, se combinan con el software y la informática para facilitar el desarrollo de biosimilares en tres niveles:

Análisis de glicosilación

En todos los anticuerpos y en muchos bioterapéuticos comercializados, el estado de glicosilación tiene un efecto directo y pronunciado sobre la estructura, la estabilidad, la vida media en suero, la inmunogeneidad y la bioactividad de la molécula, y constituye un atributo de calidad crítico (CQA).

La caracterización y comparación del perfil de glicosilación del infliximab comenzó con el examen de los perfiles de glicosilación a partir de los datos de masa de la subunidad intacta y reducida. A través de estos análisis quedó claro que el innovador y el biosimilar candidato compartían muchas glicoformas comunes, pero que cabía esperar diferencias medibles en los niveles de glicoformas entre las muestras de los productos. El análisis a nivel de glicopéptidos y glicanos liberados nos permitió abordar estas diferencias en un análisis más sensible y específico.

Los mapas peptídicos de UPLC/MSE revelaron que tanto las muestras de infliximab innovador como las de biosimilar estaban glicosiladas en el péptido tríptico de cadena pesada T26. Dentro del mapa de péptidos, podemos seguir las abundancias de las glicoformas individuales de este péptido detectadas como péptidos modificados dentro del estudio de mapeo. En una aplicación de este enfoque, demostramos que la abundancia de la glicoforma G1F variaba entre tres lotes del innovador y del biosimilar.

El porcentaje de la glicoforma G1, calculado automáticamente por el software UNIFI, mostró niveles de infliximab biosimilar en torno al 18%, fuera del rango de los lotes innovadores (alrededor del 25 al 28%) que se analizaron. Como cabría esperar de unos estudios correctamente ejecutados, se observaron tendencias de abundancia similares la glicoforma G1F al examinar los datos de masa intacta de la subunidad de la cadena pesada.

Los gráficos de líneas de tendencia de los glicopéptidos se generaron automáticamente con el software UNIFI para destacar la glicovariación de los glicopéptidos T26 en todos los lotes y réplicas analizadas. El análisis de glicopéptidos es útil como resultado ortogonal al perfil de masa intacta y al análisis de glicanos liberados (más abajo), pero puede ser particularmente importante cuando un bioterapéutico contiene múltiples sitios de glicosilación distintos.

 

Kits de preparación de muestras GlycoWorks de Waters para etiquetar, liberar y analizar N-glicanos
Kit GlycoWorks para etiquetar, liberar y analizar N-glicanos.

Los glicanos ligados a la N se liberaron enzimáticamente (PNGase F) de los lotes del innovador y del biosimilar candidato, se marcaron con una etiqueta fluorescente 2-AB (FLR) y se analizaron mediante cromatografía líquida de interacción hidrofílica (HILIC) acoplada a la fluorescencia y la detección de masa precisa. Esta preparación y limpieza de la muestra se llevó a cabo utilizando un kit GlycoWorks de Waters, con análisis mediante la solución de aplicación de glicanos, que incluye el acceso a la biblioteca de glicanos GU de Waters; esta es una opción disponible con la plataforma biofarmacéutica de Waters con UNIFI. Los datos recogidos del canal de detección FLR se utilizan para la identificación y cuantificación de los picos, y los datos de masa precisos se utilizan para la confirmación de los picos asignados por primera vez por retención. (Nuestro estudio se realizó antes de la introducción de nuestro Kit GlycoWorks RapiFluor-MS para el etiquetado y la liberación de N-glicanos, que optimiza ese proceso).

Para producir perfiles de glicanos que sean fácilmente reproducibles día a día y de instrumento a instrumento, el uso de un tiempo de retención normalizado/calibrado es parte de la metodología estándar utilizada para este análisis.

La retención de glicanos se calibra utilizando una escalera de dextrano marcada (poliglucosa) que se corre entre las muestras desconocidas, generando un gráfico de la longitud de la escalera de glucosa frente al tiempo de retención. La recalibración de los picos en valores de retención de unidades de glucosa o GU supera muchas fuentes comunes de variabilidad experimental en el análisis de glicanos liberados, y permite asignar picos basados en GU a partir de una búsqueda de glicanos marcados con 2AB en la biblioteca de glicanos GU de Waters. El software UNIFI automatizó la calibración de GU, las asignaciones de picos a partir de la base de datos de GU, la confirmación de masa de esas asignaciones y la cuantificación a partir del canal de datos de FLR.

En el caso del infliximab, había diferencias considerables entre el producto innovador y el biosimilar con respecto a la glicosilación. Esto no es sorprendente, ya que el infliximab del innovador se expresó a partir de una línea celular de ratón SP2/0, mientras que el infliximab biosimilar se expresó a partir de una línea celular CHO. Se identificaron 24 especies de glicanos en la muestra del innovador y 18 en el biosimilar. Esta mayor variedad de N-glicanos detectados en el innovador se debió principalmente a la detección de dos clases de glicanos que contienen ácido siálico (NeuAc y NeuGc) frente a las formas NeuAc observadas en el candidato a biosimilar derivado de CHO.

También se detectó un nivel consistentemente bajo (~1%) de especies de 1,3 alfa-galactosa (potencialmente inmunogénicas) únicamente en el innovador. La glicosilación representó la diferencia estructural primaria más clara entre el innovador y este conjunto de muestras candidatas a biosimilar, y probablemente requeriría que el patrocinador del biosimilar estableciera que las diferencias observadas no impactaron negativamente en los perfiles de eficacia, estabilidad y seguridad establecidos por la empresa innovadora.

Vea cómo hemos actualizado el método y los datos para comparar el innovador y el biosimilar de infliximab para utilizar la etiqueta RapiFluor-MS junto con su correspondiente GU Glycan Library.

Análisis global

La estructura de orden superior es otro atributo crítico en los productos bioterapéuticos, incluidos los agregados que están implicados en la mejora de la inmunogenicidad del producto y que afectan negativamente a la seguridad y eficacia del mismo (potencia, aclaramiento). La cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) se utiliza habitualmente para el análisis de agregados de los mAbs y otros productos bioterapéuticos.

La superposición de cromatogramas SEC del innovador y del biosimilar candidato estableció que los dímeros están presentes en niveles más altos dentro del biosimilar candidato.

La comparación automatizada de las muestras entre lotes mostró que entre el 4 y el 6% de la proteína estaba dimerizada en los lotes biosimilares, un nivel casi 10 veces superior al del producto innovador. También hubo una considerable variabilidad en el contenido de dímeros entre los lotes de biosimilares, lo que sugiere que probablemente serían necesarias mejoras en el proceso posterior o ajustes en la formulación para reducir el agregado a niveles más típicos de un producto mAb comercializado.

Análisis de variantes de carga

Las variantes de carga de las proteínas reflejan las modificaciones de los aminoácidos, la composición de los glicanos y las variantes estructurales de un bioterapéutico. El seguimiento del perfil de los picos de variantes ácidas y básicas que flanquean los picos principales del producto se emplea habitualmente como prueba de identidad, calidad del producto y estabilidad del proceso en un bioterapéutico purificado. Se puede utilizar un gradiente de pH así como un gradiente de sal para lograr una selectividad de separación óptima para el análisis de variantes de carga de infliximab. El uso de la carboxipeptidasa B para eliminar la lisina C-terminal de las cadenas pesadas puede simplificar el perfil de variantes de carga, aumentar la señal de las formas de menor abundancia por encima de los límites de detección y permitir la monitorización de más variantes de carga dentro del análisis.

La solución de plataforma biofarmacéutica de Waters con UNIFI es compatible con la tecnología Auto-Blend Plus, que automatiza la generación de fases móviles a partir de depósitos de soluciones madre simples y concentradas de tampones, sal y agua, lo que simplifica la preparación de tampones y reduce el riesgo de errores humanos en la preparación de tampones IEX. El método de gradiente Auto-Blend Plus garantiza que el pH y la fuerza iónica deseados lleguen de forma reproducible a la columna IEX para las separaciones de variantes de carga. Las variantes de carga pueden resolverse de forma óptima mediante la aplicación de un gradiente de sal, un gradiente de pH o una combinación de ambos. Auto-Blend Plus permite la búsqueda de condiciones ideales en el desarrollo de métodos y simplifica la ejecución de esos métodos una vez optimizados.

Se utilizó la cromatografía de intercambio iónico (IEX) con análisis de detección UV de infliximab intacto y el análisis LC/MS de infliximab intacto deglicosilado para comparar la variación de lisina en lotes de infliximab innovador y biosimilar. Los datos de la variante de lis del IEX estaban bien correlacionados con los resultados de la masa del mAb intacto y de la cadena pesada intacta. Esto se demostró con el ejemplo de la variante de lisina nula del mAb.

Vea cómo Auto-Blend Plus ayuda a preparar el futuro del laboratorio de control de calidad biofarmacéutico automatizando el suministro de la fase móvil, mejorando la consistencia del pH en los métodos SEC o para el desarrollo de métodos IEX.

Analice los biosimilares con la solución de plataforma biofarmacéutica UPLC QTof-MS de Waters con UNIFI.
La solución de plataforma biofarmacéutica de Waters con el software UNIFI, que incluye el ACQUITY UPLC H-Class Bio, el espectrómetro de masas Xevo G2-XS QTof, así como la preparación de muestras para moléculas grandes, estándares analíticos y columnas para el análisis de biosimilares.

Resumen de los estudios de caracterización de biosimilares

La automatización de las técnicas analíticas puede minimizar los errores en la ejecución de los métodos y aumentar la productividad. En los estudios que aquí se discuten, hemos demostrado cómo las tecnologías analíticas y las herramientas informáticas de Waters para la bioterapia han permitido una caracterización eficiente tanto del innovador como del candidato a biosimilar infliximab. El flujo de trabajo evaluó la similitud de la estructura primaria (secuencia), las modificaciones postraduccionales (PTM), la glicosilación, el patrón de enlaces disulfuro, los niveles de agregación y los perfiles de variantes de carga, todo ello utilizando la solución de plataforma biofarmacéutica con UNIFI.

Las capacidades del Sistema de Información Científica UNIFI, utilizado junto con las tecnologías de UPLC, detección óptica y MS de Waters, permiten a los investigadores generar datos con facilidad, automatizar el procesamiento y comunicar eficazmente los resultados en toda la organización. Esto permite a los desarrolladores de productos bioterapéuticos y biosimilares agilizar sus procesos, compartir sus métodos y reducir el tiempo de comercialización, garantizando la rentabilidad y el acceso de los pacientes a los modernos medicamentos bioterapéuticos.

 

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