Herramientas analíticas para el desarrollo de biosimilares: Parte 2, Análisis de péptidos

Scott Berger

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Avances en la analítica de alta resolución para la caracterización de terapias innovadoras y biosimilares

Biosimilar de Infliximab: Una comparación analítica a nivel de péptidos

En el siguiente estudio de comparabilidad de biosimilares de infliximab realizado por los científicos de Waters, se compararon tres lotes de infliximab innovador (producido en la línea celular murina SP2/0) y tres lotes de un candidato a biosimilar de infliximab (derivado de células CHO) utilizando la solución de plataforma biofarmacéutica de Waters con UNIFI.

Las muestras se analizaron a nivel de la proteína intacta, las subunidades de la proteína, la digestión de la proteína, la fracción de glicanos liberados, y para los perfiles de agregación y variantes de carga. En la mayoría de los flujos de trabajo, cada una de las seis muestras se analizó por triplicado para establecer la reproducibilidad analítica de referencia.

La confirmación de la estructura primaria (es decir, la secuencia) es fundamental para establecer la biosimilitud con un producto innovador. Esta cuestión puede abordarse indirectamente a nivel de los estudios de análisis de masas de anticuerpos intactos y de subunidades de anticuerpos, pero requiere estudios de mapeo de péptidos de alta cobertura para demostrar el orden lineal de los aminoácidos dentro de las cadenas de proteínas. Estos análisis también sirven para definir la variación del producto en cuanto a atributos como la glicosilación, el procesamiento terminal y otras modificaciones de las proteínas.

 

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En esta serie de tres partes, vamos a revisar cómo las tecnologías analíticas de LC y MS se combinan con el software y la informática para facilitar el desarrollo de biosimilares en tres niveles:

Mapeo reducido de péptidos

La confirmación de la estructura primaria (secuencia) es clave para verificar la verdadera candidatura de un biosimilar potencial. Una metodología estándar para la confirmación de la estructura primaria de la IgG es el mapeo de péptidos UPLC/MSE en una muestra reducida por disulfuro. Los mapas peptídicos UPLC/MSE reducidos pueden ayudar a resaltar e identificar las diferencias entre las secuencias de proteínas y las variantes de modificación entre el biosimilar candidato y el innovador. La MSE es una técnica de adquisición de EM independiente de los datos en la que se adquieren perfiles cuantitativos de EM y datos de fragmentación de EM en todos los péptidos dentro de un análisis de mapeo de péptidos.

Las muestras de mapeo de péptidos reducidos por disulfuro (ditiotreitol) fueron alquiladas y analizadas por UPLC/MSE para abordar los requisitos para establecer la comparabilidad de la secuencia de la proteína contra el innovador, y para identificar las variantes de péptidos modificados y determinar su abundancia relativa.

Todos los experimentos de mapeo de péptidos se realizaron en una columna ACQUITY UPLC Peptide BEH C18, 1,7-μm, 2,1 x 150 mm en la misma solución de plataforma biofarmacéutica con configuración de instrumento UNIFI (UPLC con QTof MS) que se utilizó para el análisis de masa intacta. Los datos se adquirieron, procesaron y notificaron automáticamente utilizando el Sistema de Información Científica UNIFI. Se obtuvo una alta cobertura proteica equivalente para las cadenas ligeras y pesadas del innovador y del biosimilar. El soporte de la fragmentación MSE permitió realizar asignaciones de alta confianza, y el análisis confirmó la secuencia de los péptidos terminales en las muestras de infliximab biosimilar e innovador.

Mientras que el análisis basado en la tripsina estableció la comparabilidad a nivel de péptidos, los requisitos reglamentarios son establecer la comparabilidad para la secuencia absoluta de aminoácidos en los productos innovadores y biosimilares, excluyendo las modificaciones comunes de procesamiento como la Lys C-terminal en las cadenas pesadas. La realidad de este requisito es que se requieren estudios de mapeo más extensos, normalmente empleando otras enzimas de digestión complementarias, para confirmar la fragmentación en cada enlace peptídico dentro de la proteína con un nivel de certeza aceptable.

Un desafío típico que se encuentra en el mapeo de péptidos y en el ejercicio de comparabilidad de los biosimilares es la detección, el seguimiento y la comparación cuantitativa de las modificaciones de los péptidos en el innovador y en el biosimilar candidato. En un ejemplo, el péptido T24 de HC contiene una secuencia xxxDGxxx de "punto caliente" con un alto potencial de isomerización de Asp, donde el ácido aspártico se convierte no enzimáticamente en ácido isoaspártico. El IsoAsp puede ser potencialmente inmunogénico, puede afectar a la actividad biológica y puede alterar la farmacocinética de los fármacos de péptidos y proteínas terapéuticas. Este producto de isomerización se resolverá típicamente a partir del péptido no modificado bajo condiciones de mapeo UPLC, y el péptido modificado poseerá una masa común con la forma no modificada.

Los resultados procesados mostraron que el péptido T24 del infliximab innovador contenía aproximadamente un 0,2% de la variante IsoAsp, mientras que el biosimilar candidato contenía la variante a niveles del 0,1%. Esta capacidad de detectar, identificar y cuantificar de forma fiable niveles bajos de formas peptídicas variantes es fundamental para argumentar la confianza en la biosimilitud.

Mapeo de péptidos no reducidos

La estructura de las proteínas sí determina la función, y es importante establecer que la estructura de orden superior, o 3D, se conserva en el ejercicio de biosimilaridad. Esto no sólo incluye una serie de estudios fisicoquímicos (CD, HDX, RMN, AUC...) que no se pueden discutir aquí, sino que también incluye una extensión del ejercicio de estructura primaria: la determinación de los patrones de enlace disulfuro Cys-Cys. La formación de enlaces disulfuro desempeña un papel crítico en la estabilización de la estructura plegada en 3D y en el mantenimiento de la actividad biológica de las proteínas terapéuticas.

El desorden de los disulfuros (mispairing) puede producirse durante la producción de proteínas terapéuticas, durante los pasos de procesamiento posteriores o cuando las muestras bioterapéuticas purificadas se exponen al estrés ambiental. La rotura de disulfuros y el desorden pueden manifestarse como un mal plegamiento de la proteína y la agregación del producto. Por lo tanto, es crucial confirmar la presencia de los enlaces disulfuro esperados, y demostrar la ausencia de disulfuros revueltos en las proteínas terapéuticas, para garantizar la calidad del medicamento y satisfacer a las autoridades reguladoras.

La conectividad de los enlaces disulfuro, o el patrón de unión, se determina normalmente mediante el mapeo de péptidos no reducidos. Infliximab contiene 16 enlaces S-S (12 intracadena y 4 intercadena) con la simetría molecular de una molécula IgG1, lo que genera ocho péptidos únicos con enlaces disulfuro esperados dentro del mapa no reducido. Las muestras de Infliximab se desnaturalizaron, se alquilaron y se digirieron con tripsina para generar digestiones no reducidas para el análisis UPLC/MSE.

El software UNIFI se utilizó para automatizar la adquisición de datos de UPLC/MSE, el procesamiento y la presentación de informes del mapa de péptidos no reducidos de infliximab del biosimilar candidato. Una capacidad de filtrado de datos disponible en los elementos de revisión e informe de datos del software UNIFI permite una vista personalizada de los datos, limitando los datos a la visualización de sólo los péptidos que contienen disulfuro.

Con este filtro aplicado a los datos, se confirmaron los ocho péptidos de enlace disulfuro esperados en lotes de muestras de innovadores y biosimilares, todos con confirmación por iones de fragmentos de la adquisición UPLC/MSE. Una búsqueda posterior de disulfuros revueltos, con una digestión in-silico más limitada y criterios de búsqueda de modificación variable para limitar los requisitos de búsqueda combinatoria, no detectó evidencia de disulfuros revueltos ni en el innovador ni en el biosimilar candidato.

Vea el método y los datos de nuestro estudio automatizado de mapeo de enlaces disulfuro que compara el innovador con el biosimilar de infliximab.

Siguiente: Análisis de variantes de glicosilación, agregación y carga

 

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