Un punto de inflexión para el análisis de proteínas de células huésped biofarmacéuticas

¿Se ha convertido la LC-MS en una herramienta generalmente aceptada para complementar el análisis de HCP basado en inmunoensayos?

Mi colega Catalin Doneanu y yo acabamos de regresar de Lisboa (Portugal), donde hemos asistido a la Conferencia de la BEBPA sobre el análisis de las proteínas de la célula huésped (HCP). Junto con los otros 120 asistentes, participamos en debates abiertos y reflexivos sobre las mejores prácticas para el análisis de HCP utilizando tecnologías convencionales de inmunoensayo/ELISA. Además, discutimos el uso de tecnologías complementarias -principalmente metodologías LC-MS- para validar y ampliar los resultados de estos enfoques más tradicionales para el análisis y control de HCP.

Algunas cosas destacaron en mi mente como indicadores clave de hacia dónde se dirige la industria biofarmacéutica en esta desafiante área de análisis.

Disminución de la confianza en los geles 2D y en el Western blot como herramientas de validación de ensayos HCP precisos

En la reunión hubo debates y presentaciones en los que se expresó la preocupación de que los métodos habituales de validación de los inmunorreactivos utilizados en el análisis de las proteínas de las células huésped son insuficientes para esta tarea.

En particular, varios ponentes expresaron su desconfianza en los geles 2D y en el Western blot como herramientas para demostrar la cobertura de HCP en muestras complejas, y para establecer que dichos reactivos tienen la amplia especificidad para perfilar cuantitativamente los HCP. Entre las razones citadas se encuentran problemas como la escasa especificidad, el rango dinámico limitado y el reconocimiento de epítopos lineales frente a los tridimensionales. Pero el problema más fundamental parece seguir siendo que muchas proteínas no son reconocidas por los sistemas inmunitarios animales, que generan los sueros policlonales utilizados como reactivos en estos ensayos.

La industria parece estar convencida de que, con mucho tiempo, esfuerzo y coste, puede crear inmunorreactivos razonables para los pocos HCP que permanecen en niveles significativos en el producto final. Sin embargo, se enfrentan al reto de crear ensayos que permitan a los grupos de ciencia de procesos obtener una rápida retroalimentación durante el desarrollo del proceso, y apoyar el aumento de los estudios de QbD de procesos anteriores y posteriores.

En múltiples presentaciones, se sugirió que el uso de flujos de trabajo de tipo proteómico para estudiar las fracciones purificadas por afinidad antes y después podría proporcionar una mejor comprensión de qué proteínas son reconocidas por sus reactivos. Además, este enfoque proporcionaría la capacidad de utilizar flujos de trabajo de análisis independientes de los datos, como la cuantificación LC-MSE y Top3. Estos flujos de trabajo generan una visión más cuantitativa de la composición HCP del sobrenadante de cultivo celular y de los pasos de purificación posteriores de sus productos.

¿Cuánto hay que bajar?

Los HCP de bajo nivel pueden afectar a la calidad del producto. Los debates sobre las enzimas fosfolipasas y proteasas que se ha observado que se copurifican con las proteínas bioterapéuticas reforzaron la posición de que incluso los HCP de bajo nivel pueden tener implicaciones significativas para la calidad del producto.

Una ponencia de Eli Lilly indicó que una fosfolipasa con niveles de ppm de un solo dígito podría degradar rápidamente los polisorbatos de bajo nivel utilizados en las formulaciones bioterapéuticas, aumentando así el riesgo de inestabilidad del producto y generando riesgos de eficacia/seguridad. Esto puso de manifiesto una vez más la necesidad de ir más allá de un resultado cuantitativo de ELISA y de conocer las identidades y abundancias de los HCP para minimizar los riesgos.

En el horizonte: la identificación del HCP para las vacunas

Los HCP también son una preocupación importante en los productos de vacunas - en particular, la clase de vacunas de subunidades de más rápido crecimiento que se producen y purifican como los productos terapéuticos de proteínas recombinantes "bien caracterizados". La inmunogenicidad (¡deseable en una vacuna!) no es la única preocupación sobre los HCP. Al parecer, durante la revisión de las solicitudes, los organismos reguladores han pedido datos de identificación de los HCP para los productos vacunales.

¿Es la LC-MS la respuesta adecuada a los retos actuales de las proteínas de las células huésped?

¿Qué lugar ocupa la LC-MS en la actualidad y cuáles son las expectativas de cara al futuro? El gran cambio que vi en esta reunión es que sólo un puñado de asistentes cuestionó la necesidad de que las tecnologías LC-MS complementen los ensayos tradicionales de inmunoensayo/ELISA y los enfoques de verificación basados en gel. En el otro extremo del espectro, sólo hubo unos pocos asistentes que argumentaron que la EM puede actualmente desplazar a los ensayos basados en la inmunidad como pruebas de liberación utilizadas para la especificación del producto, o como la única tecnología requerida para demostrar la validación de la autorización del HCP dentro de una presentación regulatoria.

En su gran mayoría, el consenso parece favorecer la adopción de enfoques basados en LC-MS para complementar los ensayos genéricos o de plataforma de HCP en el desarrollo de productos. Esto se debe en gran medida a su capacidad para identificar y cuantificar los HCP que pueden eliminarse mediante mejoras en el proceso, y a su fiabilidad como herramienta para validar los reactivos inmunes utilizados en los ensayos de eliminación de HCP específicos del proceso de un fármaco.

Póster: Reproducibilidad del ensayo HCP y comparabilidad HCP de un biosimilar

En la reunión, Catalin y yo presentamos un póster sobre el análisis de HCP en múltiples laboratorios del mAb de referencia del NIST y un estudio de comparabilidad de HCP entre innovadores y biosimilares. La presentación demostró que varios laboratorios pueden obtener una lista reproducible de impurezas HCP y sus abundancias a partir de muestras de mAb purificadas.

Además, el trabajo demostró que es posible que dos empresas con procesos de producción de mAb únicos produzcan un mAb bioterapéutico común que contenga un conjunto común de HCP, aunque esté presente en distintos niveles.

También lanzamos un nuevo recurso -llamado HCP Toolbox- que ha sido solicitado por investigadores en reuniones anteriores que han visto una herramienta similar de Waters para el análisis HDX-MS. La caja de herramientas ofrece una presentación con notas de los ponentes, y acceso a la literatura clave que ayudará a los investigadores a discutir el valor de LC-MS para el análisis HCP biofarmacéutico. Se puede acceder a la caja de herramientas en waters.com/HCPToolBox.

Una gran semana en Lisboa

En general, fue un placer visitar Lisboa durante una soleada semana de mayo, y asistir a esta conferencia centrada en el tema, en la que los debates honestos y abiertos sobre los retos y las estrategias para el control y la supervisión de las proteínas de la célula huésped impregnaron las sesiones del programa formal y durante las pausas y los eventos sociales. La reunión del año que viene en San Francisco debería continuar con estos magníficos debates, y estoy deseando asistir de nuevo con mis colegas de Waters.