Amgen, UCLA y la Universidad de Arizona utilizan las columnas de polifenilo BioResolve RP mAb para el cribado rápido de proteínas de membrana por LC-MS

Como científico de cromatografía en Waters, a menudo tengo la oportunidad de viajar a diferentes laboratorios de todo el mundo y reunirme con diversos tipos de investigadores. Esto me permite estar al día de las últimas tendencias y temas científicos, especialmente en el mundo del análisis biofarmacéutico, que está creciendo rápidamente. En junio de este año, visité Amgen Inc. en su campus de Thousand Oaks, California. Allí me reuní con científicos del grupo Amgen Discovery Research que estaban trabajando en el desarrollo de métodos de plataforma para el cribado de proteínas de membrana y estaban en proceso de publicar sus hallazgos en Analytical Chemistry. Sorprendentemente, cuando la autora, Jennifer Lippens, nos presentó su investigación, vi que la columna utilizada en su método LC-MS de plataforma era la columna de polifenilo BioResolve™ RP mAb, que era una columna que Waters lanzó el año pasado y una tecnología en cuyo desarrollo trabajé ampliamente.

Reimpreso (adaptado) con permiso de Lippens JL, Egea PF, Spahr C, Vaish A, Keener JE, Marty MT, et al. Método rápido de LC-MS para la determinación precisa del peso molecular de proteínas de membrana e hidrofóbicas. Anal Chem 2018. Copyright(2018) American Chemical Society.

Este artículo, "Rapid LC-MS Method for Accurate Molecular Weight Determination of Membrane and Hydrophobic Proteins" (Método rápido de LC-MS para la determinación precisa del peso molecular de las proteínas de membrana e hidrofóbicas), se puede encontrar en el Journal of Analytical Chemistry online. En él se analiza la necesidad de un método LC-MS de alto rendimiento y de plataforma para la determinación rápida y precisa del peso molecular de las proteínas de membrana, que se cree que están implicadas en enfermedades como el cáncer y que, por tanto, pueden ser aprovechables para tratamientos terapéuticos. En el desarrollo del método se tuvieron en cuenta muchos factores, y un elemento especialmente importante fue la selección de la columna.

Cuando hablé con la autora, me dijo que habían investigado muchas columnas diferentes (C3, C4, C8 y ciano), pero que no estaban satisfechos con los resultados porque las químicas no funcionaban bien con las proteínas de membrana muy hidrofóbicas, ya que las proteínas se "pegaban" irreversiblemente a la fase estacionaria. Esto era especialmente frecuente con las químicas C8 exploradas, ya que la unión es demasiado retentiva para un método de alto rendimiento. Entonces, con un último intento de utilizar una novedosa tecnología de columna recientemente introducida -la columna de polifenilo para mAb BioResolve RP- dio con un gran avance. El diseño de las partículas no sólo permite el uso de presiones de UPLC y un mayor rendimiento, sino que, según la teoría, esta unión de polifenilo funciona bien para su método debido a su alta cobertura y a su unión estructuralmente rígida que minimiza la heterogeneidad de la adsorción de proteínas. Además, la unión única permitió el uso de fases móviles modificadas con ácido fórmico (FA) al 0,1% y con ácido trifluoroacético (TFA) al 0,1%, temperaturas más bajas (de 65 °C) y la posibilidad de maximizar la resolución cromatográfica, mejorar la sensibilidad de la EM y minimizar el arrastre.

Como se muestra en la figura 2 del artículo de la revista (abajo), la columna de polifenilo fue la única capaz de separar la proteína de membrana de la acuaporinaZ formilada y no formilada. Utilizando esta columna, el método dio resultados altamente reproducibles. No sólo se probó este método para las proteínas de membrana, sino también una construcción de anticuerpos biespecíficos. La evaluación de este constructo de anticuerpos biespecíficos, que une las regiones diana de dos anticuerpos, muestra que este método rápido de LC-MS para el cribado de proteínas de membrana puede servir también para el análisis de otras especies de proteínas hidrofóbicas.

Reimpreso (adaptado) con permiso de Lippens JL, Egea PF, Spahr C, Vaish A, Keener JE, Marty MT, et al. Método rápido de LC-MS para la determinación precisa del peso molecular de proteínas de membrana e hidrofóbicas. Anal Chem 2018. Copyright(2018) American Chemical Society.

En general, fue emocionante ver el potencial que la columna de polifenilo para mAb BioResolve RP de Waters demostró a través de este nuevo método de LC-MS para proteínas de membrana. Su capacidad de adaptarse a condiciones de elución más suaves y a presiones más elevadas ofrece nuevas opciones a los científicos. Actualmente, Waters sigue trabajando en la mejora de las condiciones de elución con el lanzamiento de un nuevo aditivo para la fase móvil basado en un ácido difluoroacético purificado de calidad LC-MS (IonHance DFA). Este aditivo sirve para optimizar un método para tener la sensibilidad MS mejorada del AF y la alta resolución cromatográfica del TFA. Será interesante ver si métodos como los descritos en este artículo pueden mejorarse aún más con el uso de DFA de calidad LC-MS.