Abordar el misterio de la pérdida de muestras

Hace muchos años, una empresa biofarmacéutica me contrató para desarrollar métodos analíticos para oligonucleótidos terapéuticos. Cuando un nuevo colega me advirtió sobre la pérdida de muestras en las columnas de LC, le miré con escepticismo. "Sí", insistió, "¡parte de tu muestra de ADN puede quedar irreversiblemente unida a la columna y nunca más la verás!". Reconozco que me pareció una idea extravagante. Al fin y al cabo, lo que sube, debe bajar. Lo que se inyecta en una columna debe eluir. ¿No es así?

No es así.

A medida que adquiría más experiencia con los oligonucleótidos, aprendí que las primeras inyecciones de ácidos nucleicos en una columna nueva mostraban una pérdida de muestra apreciable y una cola de pico característica. Siempre fueron necesarias varias inyecciones para que este problema desapareciera y se lograra una "pasivación" de la columna.

Años más tarde experimenté un problema similar con los fosfopéptidos. Esta vez mi tarea era el análisis por LC-MS de pequeñas cantidades de proteínas digeridas. Rápidamente me di cuenta de que los péptidos fosforilados individualmente eludían de la columna sin problemas, mientras que los péptidos doblemente fosforilados presentaban colas desagradables, y las especies triplemente fosforiladas eludían como una joroba en mi línea de base, que sólo puedo identificar gracias a mi espectrómetro de masas. Los fosfopéptidos con cuatro o más especies fosforiladas no me daban picos reconocibles y eran imposibles de cuantificar, a menos que se aplicaran algunos trucos creativos (por ejemplo, pH básico de la fase móvil o EDTA en la muestra). Me di cuenta de que la adsorción inespecífica de la muestra al hardware de LC es mucho más común de lo que esperaba.

Muchos usuarios nunca han experimentado el problema de la pérdida de muestras debido a las superficies metálicas de las columnas de LC. Al igual que yo, practican sobre todo el análisis de pequeñas moléculas neutras, que se comportan bien desde el punto de vista cromatográfico. Incluso los químicos analíticos experimentados tienden a subestimar el problema de los compuestos que se "pegan" a las superficies de óxido metálico. Incluso pueden pensar que se trata de una idea extravagante.

Bueno, los que analizan glicanos sialilados, ácidos orgánicos tricarboxílicos, fosfopéptidos o básicamente cualquier analito ácido, lo saben mejor. Animo a todos los científicos analíticos a seguir esta nueva serie de blogs. Aquí, mis colegas y yo hablaremos de la solución a este reto analítico tan común. Hay varios trucos y emocionantes mejoras en la tecnología de LC que tal vez quiera conocer. Así que siga leyendo, ¡le ahorrará tiempo y problemas en sus futuros proyectos analíticos!