5 retos de la preparación de muestras para el bioanálisis de péptidos (y cómo superarlos)

Los científicos que han trabajado con péptidos saben que la cuantificación de péptidos puede ser un reto. Una de las claves del éxito del análisis de péptidos es la preparación minuciosa y selectiva de la muestra.

La preparación de muestras mejora varios aspectos de los análisis de cromatografía y espectrometría de masas utilizando la extracción en fase sólida (SPE) para separar químicamente diferentes analitos y ayudar a eliminar los componentes de la matriz que interfieren en una muestra.

A continuación, discutiremos cinco de los principales desafíos de la preparación de muestras de péptidos, incluyendo:

• Fijación de la proteína
• Fijación no específica (NSB)
• Solubilidad de los péptidos
• Especificidad de los péptidos
• Recuperación

Unión a proteínas
En el caso del análisis de péptidos, una preparación minuciosa de la muestra puede ayudar a abordar tanto la unión a proteínas como la unión no específica. Una forma de eliminar la unión del péptido a las proteínas (u otros componentes de la matriz) durante la preparación de la muestra es diluir el plasma 1:1 con H3PO4 al 4% o NH4OH al 5%. Dependiendo de lo fuertemente que se unan sus péptidos a las proteínas, es posible que tenga que tomar medidas más agresivas como la desnaturalización con HCl de guanidina, urea o SDS, o incluso una relación 1:1 PPT con ACN.

Unión no específica
Para abordar la unión no específica (NSB), una consideración importante durante la preparación de la muestra es el contenedor de la misma. Los péptidos son notoriamente pegajosos y pueden adherirse al vidrio. En lugar de utilizar vidrio para la preparación de la muestra, pruebe con polipropileno o materiales diseñado con superficies de alto rendimiento de baja unión de péptidos y proteínas. Esto ayudará a reducir los problemas de unión no específica.

Además, los péptidos pueden perderse durante los pasos de secado y reconstitución de la preparación de la muestra debido a la adsorción en el recipiente de recogida, o al fracaso de la resolubilización. Esto puede reducirse utilizando un formato de µElución. El uso de un producto como la placa de µElución le permite omitir la evaporación y elimina la necesidad de reconstitución, ya que el volumen de elución es generalmente de sólo 25-50 microlitros. Basta con diluir el eluido 1:1 con agua e inyectarlo.

Solubilidad de los péptidos
Para evitar la precipitación de sus péptidos, se sugiere limitar la concentración orgánica a no más del 75%. También puede utilizar modificadores para promover la solubilidad, pero puede requerir concentraciones más altas que las que ha utilizado con las moléculas pequeñas. Pruebe un rango del 1% hasta el 10% de ácido o base, como TFA, FA, AA o NH4OH.

Especificidad de los péptidos
La cuantificación de péptidos requiere métodos altamente sensibles y reproducibles. En muchos casos, la precipitación de proteínas, muy popular en el bioanálisis de moléculas pequeñas, no será lo suficientemente limpia para los métodos sensibles de péptidos. La especificidad se consigue creando un método de preparación de muestras que utilice enfoques de limpieza ortogonales, tanto de fase inversa como de intercambio iónico, para capturar selectivamente su péptido objetivo, al tiempo que le permite lavar las interferencias de la matriz no deseadas. A continuación, concentre su péptido en un pequeño volumen de elución que pueda diluirse con un poco de agua e inyectarse directamente en el sistema LC-MS.

Recuperación
Las recuperaciones bajas o variables suelen ser síntomas de uno de los cuatro problemas señalados anteriormente. Cuando experimente recuperaciones bajas, revise los pasos que puede dar para reducir la unión a proteínas, la unión no específica, la solubilidad del péptido y aumentar la especificidad del péptido en su protocolo de limpieza de muestras. Una o todas ellas pueden ser la clave para ayudar a mejorar su método bioanalítico de péptidos.

Información adicional sobre péptidos y preparación de muestras

• Flujo de trabajo en 4 pasos para el análisis optimizado de péptidos
• Campo de entrenamiento en bioanálisis de péptidos y proteínas
• Muestras perdidas en el contenedor: La unión no específica y el impacto de los agentes bloqueadores
• Navegando por los desafíos asociados con el bioanálisis de péptidos terapéuticos y endógenos, una serie de videos de seis partes

Ver el episodio 2: