5. Perspectivas: Cuantificación de proteínas mediante el método del péptido sustituto

Personal de Waters

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Tiempo de lectura: 4 minutos

Bioanálisis de productos biológicos

¿En qué pueden ponerse de acuerdo los principales científicos de la industria farmacéutica y de las CRO? Que la industria biofarmacéutica está creciendo y que la cuantificación de proteínas para el bioanálisis es difícil, pero usted tiene opciones. Las siguientes reflexiones le pondrán al día sobre los retos, problemas y soluciones actuales.

1. La biofarmacia crece rápidamente

El desarrollo de medicamentos biofarmacéuticos está experimentando un rápido crecimiento. Más de 600 productos biológicos cuentan con la aprobación de la FDA de EE.UU. y más de 50 anticuerpos monoclonales (mAbs) están aprobados en EE.UU. y la UE [1], con al menos otros 300 mAbs en desarrollo [2]. Este crecimiento obliga a los científicos a enfrentarse a una serie de retos que no están presentes en la cuantificación de moléculas pequeñas(como éstas).

2. Los enfoques bioanalíticos actuales tienen limitaciones

La cuantificación de proteínas implica flujos de trabajo complejos y que requieren mucho tiempo, así como un arduo desarrollo de métodos. Los ensayos de unión de ligandos (LBA) se han empleado tradicionalmente para la cuantificación debido a su alta sensibilidad, bajo coste y alto rendimiento. A pesar de estas ventajas, los LBAs tienen un rango dinámico lineal limitado, conllevan un riesgo de reactividad cruzada entre metabolitos/análogos, y mantienen la dificultad con el multiplexado. Además, si se requiere un nuevo anticuerpo LBA para su proteína de interés, el tiempo de desarrollo y el coste son significativos.

3. Las ventajas de la LC-MS

La cromatografía y la espectrometría de masas (LC-MS) han surgido como un enfoque muy eficaz para el bioanálisis de proteínas, especialmente para el descubrimiento de fármacos, el desarrollo temprano y los estudios preclínicos. La LC-MS presenta una serie de ventajas en comparación con los LBA, como una mayor especificidad y precisión, multiplexación (puede detectar múltiples proteínas en una sola ejecución), un rango dinámico lineal más amplio, un desarrollo de métodos más rápido (a menudo de días a semanas) y la no necesidad de desarrollar anticuerpos específicos para proteínas.

La cuantificación de proteínas por LC-MS ofrece una variedad de opciones, cada una de ellas con ventajas y advertencias. Utilizando los mAbs como ejemplo, hay dos flujos de trabajo principales en la caja de herramientas: Los análisis intactos y los digeridos. Las ventajas de cada uno de ellos dependen de las necesidades y restricciones particulares de cada científico. Aunque este blog se centra en el enfoque del péptido sustituto, vale la pena mencionar que el análisis de mAb intacto es posible (incluso a nivel de 1 ng).

Para el análisis intacto mediante LC-MS, un espectrómetro de masas de alta resolución (HRMS) como un QTof MS es ideal porque ofrece el rango de masas más amplio (>150 Kd) y una resolución muy alta. Los mAbs intactos pueden ser difíciles de ionizar porque tienen envolturas muy cargadas, atraen iones salinos y están muy glicosilados, lo que requiere una preparación exhaustiva de la muestra.

Los instrumentos HRMS también ofrecen la oportunidad de realizar análisis cualitativos y de utilizar la movilidad iónica como etapa de separación adicional. Para obtener más información sobre las ventajas de la movilidad iónica, consulte esta reciente entrada del blog del Dr. Nigel Ewing.

4. El enfoque de los péptidos sustitutos

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El enfoque del péptido sustituto se ha convertido en la estrategia más utilizada para la cuantificación de proteínas basada en la EM debido a su alta sensibilidad y especificidad, y a la amplia disponibilidad de espectrómetros de masas de triple cuadrupolo (TQ) en los laboratorios bioanalíticos [3].

En este enfoque, la proteína objetivo se digiere en péptidos más pequeños. A continuación, se utilizan uno o varios péptidos únicos con buena selectividad y sensibilidad como medida indirecta (o sustituta) de la proteína objetivo. Los péptidos sustitutos se analizan entonces mediante LC-MS.

La digestión es esencial para aprovechar las ventajas del espectrómetro de masas TQ, ya que la relación masa-carga es de 2048 m/z y el rango de masa total es de aproximadamente 6000 Da. Un mAb intacto tiene una masa muy grande, aproximadamente 150 kD, demasiado grande para un análisis intacto en un TQ MS.

Por último, debido a su prolífico uso y a su alta sensibilidad, los espectrómetros de masas TQ son considerados por las agencias reguladoras mundiales como el estándar de oro para la cuantificación y, por tanto, son ideales para el método del péptido sustituto.

5. La compleja preparación de la muestra no es un obstáculo

Tanto si se utiliza LBA, como si es intacta, o la digestión, los flujos de trabajo de cuantificación de proteínas, incluidos los requisitos de preparación de muestras, son inherentemente lentos. El enfoque del péptido sustituto no es una excepción. Hay que optimizar múltiples pasos y múltiples aspectos dentro de cada paso. Además de la complejidad del flujo de trabajo y la falta de estandarización, la digestión reproducible y rápida de proteínas sigue siendo un reto, especialmente para los usuarios novatos.

Para resolver estos problemas, los científicos de Waters han desarrollado los kits ProteinWorks™ Digest. Con cinco opciones, estos kits validados simplifican el flujo de trabajo del bioanálisis de proteínas al reunir los reactivos fiables, las herramientas de extracción en fase sólida por microelución, un módulo de recogida y los protocolos probados que los analistas necesitan para preparar las muestras con éxito. Los kits y sus protocolos están diseñados para reducir los pasos y las variables del flujo de trabajo, al tiempo que proporcionan resultados reproducibles, sensibles y precisos.

Más información de nuestros expertos

Una de las expertas más conocidas de la industria en bioanálisis de péptidos y proteínas, la Dra. Erin Chambers, habló sobre "Consideraciones prácticas para el bioanálisis de proteínas por LC/MS mediante el enfoque de péptidos sustitutos" en una reciente conferencia de la industria. Escuche sus ideas en este vídeo.

Obtenga los detalles en nuestras notas de aplicación

Referencias:
  1. https://www.antibodysociety.org/news/approved_mabs.php
  2. https://www.bptc.com/sites/default/files/articles/ecker-2015-the_therapeutic_monoclonal_antibody_market-rprnt.pdf
  3. https://www.labome.com/method/Quantitative-Bioanalysis-of-Proteins-by-Mass-Spectrometry.html